抗人生长激素免疫血清的制备和鉴定

Using small dosage of human growth hormone to immunize rabbit or guinea pig, it is able to induce anti-hGH antibody formation with high titre and high affinity that could be applied to hGH RIA. In the present study five rabbits and three guinea pigs were immunized with 125-200 micrograms and 250-285 micrograms per animal of hGH respectively, followed by boosters of 10-20 or 160-250 micrograms of hGH at 2-4 week intervals for 6 or 3 months. Blood was drown 1-2 weeks before each booster for determination of antibody formation. Antibody titre and affinity were successively observed and specificity of antibody was determined for the final bleeding. It was shown that titres of immune sera from guinea pigs were much higher than those of rabbit immune sera, but vice versa for antibody affinity. This might be due to larger immunogen dose used for guinea pigs than for rabbits. Fourteen different peptide hormones were tested in reference to cross-immunoreactivity to anti-hGH antibody. It could be demonstrated that the major cross-reactive hormones are hFSH and hLH, and hTSH also reacts to rabbit anti-hGH immune sera at a lesser degree. These cross reactivities are obviously owing to the molecular homogeneities between hGH and these hormones especially of their alpha-subunits.     

抗人生长激素免疫血清的制备和鉴定

本文报告用小剂量人生长激素免疫家兔和豚鼠,制备抗人生长激素免疫血清的经验。用放射免疫法鉴定该免疫血清的效价、亲和力和特异性。结果说明,无论用家兔或豚鼠,均可获得适用于放射免疫分析的抗人生长激素免疫血清。     

重组人穿孔素肽段的体外杀伤肝癌细胞活性

目的 :以肝癌细胞系SMMC 772 1作为靶细胞 ,观察重组人穿孔素 (PFP)N端肽段 (rhPFP N)及C端肽段 (rh PFP C)体外杀伤肿瘤细胞的活性。　方法 :用大肠杆菌表达PFP N和PFP C与谷胱甘肽转移酶 (GST)的融合蛋白 ,对表达产物进行纯化 ,将不同浓度的GST rhPFP C或GST rhPFP N加入体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1,2 4h后用镜检和MTT法检测细胞存活情况。　结果 :用GST rhPFP N或GST rhPFP C处理后 ,可见SMMC 772 1细胞膜溶解和细胞破裂。用MTT法检测 ,实验组A值显著低于对照组 (P <0 .0 0 1)。GST rhPFP C和GST rhPFP N浓度为 2 .5ml L时 ,其杀伤活性分别为 33.38%和 5 .90 %。　结论 :rhPFP C和rhPFP N对人肝癌细胞SMMC 772 1均有明显的杀伤活性 ,rhPFP C对SMMC 772 1的杀伤活性显著高于rhPFP N。     

抗人IgG单克隆抗体制备和鉴定

以人ＩｇＧ为抗原，采用杂交瘤技术获得６株不同性质的抗人ＩｇＧ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）（ＡＩ２，ＡＩ３，ＡＩ４，ＡＩ５，ＡＩ６和ＡＩ７）。ＡＩ２ＭｃＡｂ具有抗ＩｇＧ１亚类的特异性，可识别ＩｇＧγ链和Ｆ（ａｂ）２片段，作用位点可能在人ＩｇＧ１铰链区。ＡＩ３，ＡＴ７，ＭｃＡｂ分别为ＩｇＧ３，ＩｇＧ４亚类限制性ＭｃＡｂ，可能作用于ＩｇＧＣＨ１区。ＡＩ４ＭｃＡｂ铰链区。ＡＩ３，ＡＩ７，ＭｃＡｂ可识别ｘ和λ链。     

抗人红细胞单克隆抗体的制备和鉴定

用O型人红细胞免疫的Balb/c小鼠脾细胞和NS--1骨髓瘤细胞融合、克隆后,获得两株杂交瘤细胞株。两株细胞分泌的单克隆抗体都是IgG_s亚类。文中对此类抗体的特性进行探讨。吸收试验表明,这两种单克隆抗体并不是和红细胞H抗原反应,但可能是同ABO各型红细胞上一种共同抗原反应。     

人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定

目的：在大肠杆菌表达人lrg,制备鉴定人Lrg免疫血清．方法：构建pcTAT-lrg重组表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白;对表达的融合蛋白采用镍柱和SDS-PAGE纯化;以纯化蛋白作为免疫抗原,对新西兰白兔实施多次免疫(问隔时间分别为1mo,3wk,2wk)．结果：获得兔抗人Lrg免疫血清．经过ELISA和Western Blot检测,效价在1：1000以上．真核细胞实验表明,6His-TAT-Lrg蛋白具有良好的穿透性,可以在30min内从培养液进入细胞质;免疫组化实验表明Lrg是一种胞质蛋白;兔抗人Lrg免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测．结论：制备得到兔抗人Lrg免疫血清,为lrg的功能研究打下基础。     

人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。　结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。　结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。     

抗人IgG单克隆抗体制备和鉴定

以人ＩｇＧ为抗原，采用杂交瘤技术获得６株不同性质的抗人ＩｇＧ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）（ＡＩ２、ＡＩ３、ＡＩ４、ＡＩ５、ＡＩ６、和ＡＩ）。ＡＩ２ＭｃＡｂ具有抗ＩｇＧ１亚类的特异性，可识别ＩｇＧγ链和Ｆ（ａｂ＇）２片段，作用位点可能在人ＩｇＧ１铰链区。ＡＩ３ＡＩ、ＭｃＡｂ分别为ＩｇＧ３、ＩｇＧ４亚类限制性ＭｃＡｂ，可能作用于ＩｇＧＣＨ１区。ＡＩ４ＭｃＡｂ可识别χ和λ型ＩｇＧ四个亚类以及Ｆ（ａｂ＇）２片段，不识别游离χ、λ链。ＡＩ５ＭｃＡｂ特异地抗ＩｇＧ１结合型χ，作用于ＩｇＧ独特型位点。ＡＩ６ＭｃＡｂ只抗λ型ＩｇＧ，可能作用于ＩｇＧＣＬ区。６种抗人ＩｇＧＭｃＡｂ除了ＡＩ５外，均能用于人血清中ＩｇＧ的检测。     

抗人肌红蛋白单克隆抗体的制备和初步鉴定

用纯化的人肌红蛋白（Ｍｂ）抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠通过细胞杂交技术。获得１０株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株．其中３株分泌ＩｇＧ_１亚类抗体，２株为ＩｇＧ_（２ａ），５株为ＩｇＧ_（２ｂ）．间接ＥＬＩＳＡ法证明单抗腹水与Ｍｂ起特异性反应，与人血红蛋白（Ｈｂ）．人白蛋白（Ａｌｂ）无交叉反应．免疫印迹检测结果表明，６株单抗腹水能特异性识别分子量１７ＫＤ的Ｍｂ，抗Ｍｂ单克隆抗体的制备，对于急性心肌梗塞早期诊断很有应用价值．     

高效价兔抗人免疫血清的制备

动物免疫血清是我们在医学教学、科研及临床检验工作中,经常用到的试剂,高效价免疫血清制备的关键在于佐剂的正确使用,抗原剂量要适中,免疫间隔时间长短要适当等,注意这些方面有利于高效价免疫血清的制备。     

人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体的初步鉴定

目的：制备高效价的人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体（GPA McAb),为研制快速全血凝集试剂提供关键的双功能抗体成分。方法：首先用MNGP亚型GPA,经SPDP与小鼠血清白蛋白连接后,常规免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备GPA McAb;用ELISA和血凝方法对克隆进行筛选和鉴定。结果：4次融合共获3个可分泌高效价GPA McAb细胞株（3F6、5C7和5G3）。分泌的单克隆抗体均与GPA发生特异性反应,但均不引起人A、B、AB和O型红细胞凝集,属于人红细胞GPA的特异性非凝集抗体。在3株抗体中,2株为IgG1亚型,1株为IgG2亚型。结论：小分子GPA经与同种动物（免疫用动物）血清白蛋白连接后用作免疫抗原,研制的2株IgG1亚型抗体可用于全血凝集试剂中双功能抗体的制备。     

抗人β2微球蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗人β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）单克隆抗体并对其进行鉴定。方法：用高纯度的β2-MG免疫BALB／C小鼠，按常规技术制备针对β2-MG不同抗原表位的单克隆抗体，并对其进行纯化，测定抗体亚类、抗原表位分析等。结果：筛选出10株抗人β2-MG杂交瘤细胞株，ELISA间接法证实这组单克隆抗体仅与β2微球蛋白反应，而与其他蛋白无交叉反应，IgG亚类鉴定6株为IgGl，2株为IgG2a，1株为IgA，1株为IgM。结论：获得特异性的抗人β2微球蛋白单克隆抗体，为试剂盒的开发研究奠定基础。     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

抗人Atg5单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人Atg5单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法以人Atg5重组蛋白作为免疫原免疫Balb／c小鼠,取其脾细胞与SP2／O细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗人Atg5单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA、westernB10t、免疫组化鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、亚型及亲和力常数。结果成功筛选到一株能稳定分泌抗人Atg5单抗的细胞株1E783H9,亚型鉴定重链为IgG2b,轻链为kappa链。ELISA法测定腹水抗体效价为1：4．096×lO。,抗体亲和力常数为7．309×10^8mol／L;westernblot显示此单抗能特异性识别人子宫颈癌Hela细胞系中的天然人Atg5蛋白;细胞免疫组化进一步显示Atg5表达在细胞质中。结论成功制备了抗人Atg5单克隆抗体,为进一步研究其与宫颈癌关系及在临床上的应用奠定了基础。     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的获得抗人降钙素原(procalcitonin,PCT)单克隆抗体,并鉴定其基本特性。方法从NCBI数据库中获得PCT编码序列,以原核表达系统表达PCT重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,获得筛选单克隆抗体的筛选原;综合应用多种生物信息学分析软件预测PCT中潜在的B细胞表位肽,用合成肽对BALB/c小鼠进行免疫,纯化单克隆抗体,通过间接ELISA、Western blot和免疫组化鉴定获得的单克隆抗体。将获得的单克隆抗体作为捕获抗体,经过配对建立检测重组PCT的ELISA体系,并初步对临床血清进行了检测。结果成功获得3株PCT特异性单克隆抗体,分别为2-D7、2-H12和4-H12,亚类分别为IgG1和IgG2a,最高效价为1∶1 024 000,亲和力最高可达到1.3×109L/mol;选取2-D7经Western blot鉴定能够检测重组PCT蛋白,经免疫组化证实能特异性识别甲状腺组织中PCT蛋白,经过配对成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,运用建立体系检测临床血清PCT含量时发现正常组与细菌培养阳性组之间具有显著差异。结论成功表达了人PCT重组蛋白,获得了3株高特异性和高亲和力的PCT单克隆抗体,成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,并初步用于临床样本检测。     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备人类疱疹病毒8型（HHV-8）包膜糖蛋白K8．1的单克隆抗体，并对其特异性进行鉴定。方法：用异丙基硫代一β—D一半乳糖苷（IPTG）诱导含重组质粒pGEX-6p-1 ＋K8．1的大肠杆菌BL21表达符胱甘肽-S-转移酶GST／K8．1融合蛋白，将以包涵体形式存在的融合蛋白进行变性、复性、复性后的Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化。以纯化的GST／K8．1融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠．常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌K8．1单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化染色（IHC）和Western blot法鉴定单抗的特异性。结果：建立了一株稳定分泌抗K8．1单抗的杂交瘤细胞株．命名为3G10：IHC和Westerfl blot法显示．3G10株单抗能特异地识别HHV-8K8．1蛋白。结论：成功制备出抗HHV-8包膜糖蛋白K8．1的单克隆抗体。     

组织因子单克隆抗体及对照抗体的制备、纯化和鉴定

目的纯化组织因子(TF)单克隆抗体及对照抗体。方法给小鼠腹腔注射杂交瘤8A3和9E10细胞,产生的腹水应用凝胶过滤层析法和Protein A亲和层析法纯化组织因子抗体及对照抗体,并用SDS-PAGE和BCA法检测纯化后单克隆抗体的纯度及蛋白浓度。结果单抗纯化后电泳重链和轻链都呈一条带,TF抗体和对照抗体的最终浓度分别为0.7726mg/ml和0.8592mg/ml。结论应用层析法和凝胶过滤和Protein A亲和分离层析法纯化抗体,能够得到纯度较高的单克隆抗体。     

全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定?方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠?采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体?通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA?斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力?结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2?双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型?间接ELISA?斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株?Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合?2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为 2.62 × 10-10 mol/L?4.06 × 10-11 mol/L?结论:筛选制备了2株特异性?高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体?本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础?