类风湿性关节炎细胞水平建模四种方法比较

目的 比较四种方法 在培养类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞(FLS)中的异同,为研究RA提供较好的体外实验模型建模方法 .方法 20例滑膜组织标本均用组织块法、单胶原酶消化法、单胰酶温消化法和双酶消化法四种方法 分离、培养RA FLS,均取培养第7日细胞计数,取第4代细胞鉴定,免疫组化鉴定细胞,测定分离细胞的数量和纯度.结果 四种培养方法 的培养时间比较,单胶原酶法>双酶消化法>组织块法>单胰酶法(P＜0.05).组织块法及双酶消化法所得细胞数较单胶原酶法及双酶消化法少(P＜0.05).第4代细胞均以FLS为主(>95%).结论 四种方法 体外培养可获得生物学特性稳定的RA FLS细胞系,其中组织块法是细胞水平建立RA体外实验模型成功率较高的方法 ,单纯胰酶法是较快速的方法 .     

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

三种培养原代支气管成纤维细胞方法的比较

目的 探讨建立适用于SD大鼠支气管成纤维细胞原代培养的方法.方法 取重量为150~180 g的SD雄性大鼠的支气管组织,采用Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶联合消化+组织块黏附法、胰酶+胶原酶联合消化(双酶消化法)+组织块黏附法、组织块黏附法进行原代支气管成纤维细胞的培养.利用镜下观察细胞的生长特点;免疫荧光染色法鉴定细胞的类型及纯度;细胞的增殖活性用CCK-8检测并绘制生长曲线.结果 酶消化+组织块黏附法培养使细胞游出速度更快、细胞数量产生更多.组织块黏附法培养的细胞爬出相对缓慢、培养周期更长、获得的细胞数量相对较少.CCK8增殖曲线呈S形.培养48 h,经酶消化法分离得到的成纤维细胞已经游出,约有60%以上细胞已经贴壁,培养6~7 d可传代.组织块贴壁法培养5 d时,细胞开始从组织块边缘缓慢爬出,随后从组织块周围延伸长,14 d左右可传代.使用酶消化法培养的支气管成纤维细胞中可混有杂细胞团,为提高成纤维细胞的纯度可通过差速贴壁法纯化.结论 双酶消化法+组织块黏附法可以更高效、快速的分离和获取支气管成纤维细胞,为研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑提供了充足的种子细胞.     

酶消化组织块法培养人心房成纤维细胞

目的 建立人心房成纤维细胞体外培养的有效方法。方法 无菌条件下将人右心耳标本剪成1 mm3大小组织块,经 1.25 g/L胰蛋白酶预消化15 min后,用组织块贴壁法培养。通过倒置显微镜观察培养细胞生长及形态学特点,使用免疫荧光法进行细胞鉴定。结果 培养3~4 d后可见细胞自组织块爬出,7~9 d后细胞可传代,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形。免疫荧光染色发现其抗波形蛋白（vimentin）及抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色阳性,抗血管性血友病因子（vWF）染色阴性,鉴定为肌成纤维细胞。结论 酶消化组织块法培养人心房成纤维细胞/肌成纤维细胞简便、高效,方法可行。     

负载食管癌抗原的DC诱导特异性CTL对食管癌细胞体外杀伤作用观察

目的观察负载食管癌抗原的树突状细胞（DC）活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对食管癌细胞的体外杀伤作用。方法冻融法获取食管癌细胞抗原,联合应用粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导培养外周血DC并负载肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,制备特异性CTLs。将其加入食管癌细胞中培养48 h,用MTT法检测食管癌细胞裂解率,ELISA法检测γ干扰素（γ-IFN）水平。结果负载食管癌抗原的DC激活的CTLs表现出对食管癌Eca109细胞的特异性杀伤作用,γ-IFN水平为（1 625±37.55）pg/ml;而对A549细胞仅有微弱的杀伤作用,γ-IFN水平为（169.04±13.81）pg/ml。未负载食管癌抗原DC刺激的CTLs对食管癌细胞几无杀伤作用。结论负载食管癌抗原的DC激活的CTLs在体外对食管癌细胞能产生高效而特异性的杀伤作用。     

体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞

目的探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞(UMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的方法。方法用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶和0.25%胰蛋白酶消化法原代分离培养UMC细胞,用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞,镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果脐带组织分离培养第3天,有少量UMC贴壁生长,细胞膜周围有折光性,形态类似于成纤维细胞;皮肤组织块贴壁培养第7天,有HSF爬出,呈长梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长,UMC和HSF数量逐渐增多,细胞生长状态良好。结论应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培养出UMC和HSF。     

Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞

目的建立科学有效的大鼠成骨细胞体外培养模式,建立成熟合理的体外培养大鼠成骨细胞鉴定程序。方法采用I型胶原酶阶段消化法来消化新生大鼠乳鼠颅骨,来获得成骨细胞进行体外培养、扩增和鉴定。通过绘制成骨细胞生长曲线,倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,基质钙结节形成观察;进行钙-钴法碱性磷酸酶(ALP)染色;I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞。结果Ⅰ型胶原酶改良阶段消化法获得的大鼠成骨细胞纯度较高,增殖较快;ALP染色可见体外培养成骨细胞胞浆内棕褐色阳性颗粒;免疫组化法检测I型胶原可见成骨细胞胞浆呈棕黄色阳性着色,显微镜计数阳性细胞比例为87.3%;体外培养超过3w的成骨细胞可见基质钙结节形成。结论Ⅰ型胶原酶阶段消化法原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效的成骨细胞原代培养方法。     

神经母细胞瘤体外细胞系的构建方法

目的 对神经母细胞瘤(NB)进行体外培养，探讨神经母细胞瘤(NB)体外建系的方法。方法 NB患儿新鲜手术标本，采用组织块培养法、酶消化培养法建立原代细胞系；用选择性酶消化法和机械刮除法进行细胞纯化；从细胞形态学、神经特异性烯醇化酶染色、软琼脂克隆形成实验三方面对细胞进行初步鉴定，证实所培养细胞是否为NB细胞。结果 两种细胞培养法均可培养出NB细胞，纯化后可得形态均一的细胞系。结论 可采用适当的细胞培养方法建立神经母细胞瘤的体外细胞系。     

人心包外脂肪干细胞原代培养

目的：建立人心包外脂肪干细胞体外培养研究模型。方法采用胶原酶消化和差速贴壁法纯化细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,HE染色,免疫荧光检测细胞表面相关抗原表达。结果形态学特征以及脂肪干细胞特异性相关抗原检测证实,得到高纯度人心包外脂肪干细胞。结论利用胶原酶消化法能成功分离并培养人心包外脂肪干细胞,可用于组织工程学进一步研究。     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的免疫组化鉴定

目的：鉴定基因工程抗体库技术构建的人源性大肠癌自然致敏噬菌体Fab段抗体库与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的特异性结合活性。方法：通过免疫组化的方法检测抗体库对人大肠癌标本及体外培养的大肠癌lovo细胞的结合活性，并取绒毛状腺瘤、胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果：30例大肠癌有22例发生了阳性反应；肠息肉、胃癌、食管癌、正常肠粘膜各取20例，发生阳性反应的分别为13例、5例、4例和1例，体外培养的胃癌、肝癌细胞未发生阳性反应。结论：大肠癌噬菌体抗体库能较特异性地与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞结合。     

低浓度混合酶改良消化法体外培养SD大鼠面颌肌细胞

目的观察低浓度混合酶改良消化法体外培养SD大鼠面颌肌细胞的结果。方法分离SD大鼠颌面部咬肌区肌肉组织,先用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化后再用0.1%的Ⅰ型胶原酶和0.125%的胰蛋白酶(1∶1)低浓度混合酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化,所得细胞进行结蛋白(Desmin)免疫组化染色。结果体外培养所得细胞Desmin胞质阳性率达95%。结论采用低浓度混合酶消化和差速贴壁法体外培养SD大鼠面颌肌细胞可获得纯度高、产量高、活性强、稳定性好的面颌肌细胞。     

混合生物人工肝细胞成分的初步研究-乳猪肝细胞的分离和培养

为探讨乳猪肝细胞分离、体外培养的条件及其生长方式。方法用两步灌注结合胶原酶消化法分离乳猪肝细胞,用激素条件培养基进行体外培养,ＥＤＴＡ消化传代,测定细胞的活性,观察其生长方式,群体倍增时间及蛋白质和ＤＮＡ的合成。结果在胶原酶浓度为０．０７５％,细胞的收获和成活率较高,原代和传代的肝细胞生长良好,原代肝细胞倍增时间较短,ＤＮＡ和蛋白质的合成也较活跃,与传代细胞相比,无明显差别（Ｐ＞０．０５）。结论乳猪肝细胞分离所需的胶原酶浓度较高,在一定的条件下,能分裂增殖,且能进行传代,同时能维持其基本特性。     

成年C57BL／6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定

目的尝试优化体外培养成年小鼠小肠Cajal间质细胞的操作方法,为深入研究该细胞的生理功能提供一定细胞模型。方法6～8周龄C57BL／6小鼠禁食24h,无菌条件下截取3～5cm中段空肠,分离平滑肌肌条并剪至小块后使用Ⅱ型胶原酶消化20min,离心后进行组织块原代培养,观察不同时期细胞形态。使用c—Kit免疫荧光染色鉴定细胞表型是否为Cajal间质细胞。Fluo-3AM染色细胞内钙,观察细胞能否自发产生钙离子振荡。结果分离所得组织不含空肠上皮和固有层组织,仅为小肠肌层。联合使用胶原酶消化和组织块原代培养能够较方便地培养出原代细胞,该细胞呈梭形,且具有细胞突起,彼此交织成网状。该细胞免疫荧光染色呈c—Kit阳性,平滑肌标志物SMA阴性。钙成像分析显示其能够产生钙离子振荡。结论联合使用酶消化和组织块培养能够较方便地培养出成年小鼠的空肠Cajal间质细胞,该方法为后续探讨Cajal间质细胞的生理功能及机制提供了一定的细胞模型。     

胶原酶I消化联合筛网过滤法用于人与小鼠着床窗口期子宫内膜原代培养的效果比较

目的 观察胶原酶I消化联合筛网过滤法用于人和小鼠着床窗口期子宫内膜原代培养的可行性及效果.方法 分别以人排卵后5～7d及妊娠第4天为人和小鼠子宫内膜着床窗口期,无菌操作取子宫内膜组织,用胶原酶I消化、筛网过滤后行原代细胞培养并鉴定,观察培养细胞的形态及纯度.结果 人和小鼠原代培养成功率分别为80％、83％(P＞0.05),失败原因包括标本污染及细胞数少;人和小鼠原代培养上皮细胞纯度比较无显著差异,但前者分离的细胞包括上皮细胞和基质细胞两种.结论 胶原酶I消化联合筛网过滤法可为人和小鼠胚胎植入及子宫内膜容受性等进一步研究提供体外培养模型,但取材方法及培养细胞种类有异.     

腺病毒介导的COX—2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响

目的：验证环氧合酶（COX）－2在食管癌组织是否高度表达；构建表达人COX－2反义RNA的腺病毒载体，研究其对人食管癌细胞生长的抑制作用。方法：用免疫组织化学方法（SP法），检测COX－1、COX－2在38例食管癌癌旁组织和癌组织中表达情况；并将人COX－2的cDNA片段反向构建于腺病毒载体并转染食管癌细胞EC9706，采用生长曲线、用^3H-TdR、^3H-Leucine掺入法及免疫细胞化学的方法，研究其对COX－2表达、及对食管癌细胞生长、DNA复制及蛋白合成的影响。结果：COX－2在食管癌中的阳性表达率为91．7％，主要为癌组织的表达，而在癌旁正常组织无表达或弱表达，而COX－1在食管癌正常组织和癌旁组织均有不同水平的表达。同时，我们构建的重组腺病毒感染肿瘤细胞后，COX－2表达水平与对照组比较明显降低，^3H-TdR和^3H-Leucine掺入量均明显减少，与对照组比较P＜0．001；同时发现食管癌细胞的生长细胞计数随时间递减，对照组生长细胞计数随时间而递增，Ad-LacZ组与空白对照组生长曲线几乎重叠。结论：COX－2可能与食管癌的发生发展有关；抑制COX－2的表达可能是治疗食管癌的一种新途径。     

组织块贴壁法培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的培养、鉴定SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞。方法采用组织块贴壁法分离培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果培养出的平滑肌细胞呈长梭形生长,镜下可见培养细胞呈典型的"峰-谷"状生长,高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法体外培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞操作简单、纯度较高、可行性高。     

CD95基因转导食管癌细胞的体外抑瘤效应

目的 观察CD95基因表达株表达的CD95蛋白对体外培养食管癌细胞的抑制作用。方法 Western blot检测CD95基因转导前后CD95蛋白的表达水平。直接记数法描述转导株的细胞生长曲线;MTT显色法比较转导前后细胞的体外增殖能力;药敏实验观察转导细胞对VCR、5-FU等化疗药物的敏感性;软琼脂集落形成实验观察基因转导前后细胞的克隆形成力。结果 杂交结果表明．转导株CD95蛋白水平的表达明显高于非转导株。转导细胞的细胞倍增时间(2d)、对数生长期(3d～7d)等均体现了比非转导株(0．8d,2d～8d)更为缓慢和处于抑制状态,体外生长速度的增长指数下降,集落形成能力低下(0．9％),而对VCR、5-FU等化疗药物的敏感性明显增加。结论 CD95基因在食管癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体的介导,CD95基因导入食管癌细胞后．能有效地表达CD95蛋白。CD95基因转导株的表达蛋白能有效地抑制体外培养的食管癌细胞的生长。     

组织工程学血管构建中脐带内皮细胞分离及冻存技术的初步研究

目的为制备组织工程学血管随时提供种子细胞,对人脐静脉内皮细胞分离、体外培养、传代及鉴定方法进行研究,并研究其冻存技术,探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性.方法新鲜脐带49务,脐静脉内灌注消化酶消化,获得内皮细胞,进行体外培养,相差显微镜下观察酶消化结果及所获内皮细胞贴壁生长规律;采用VⅢ因子免疫荧光染色,鉴定所获内皮细胞及其纯度;加入冻存液,置于液氮进行保存,复苏后,分别进行台酚蓝拒染试验及MTT还原试验,绘制细胞生长曲线.结果血管内灌注消化液法可获得取高纯度的内皮细胞,胰酶和胶原酶混合灌注法消化结果优于单纯胰酶及胰酶和EDTA组,各组消化时间均以10～15min为佳;混合酶消化组细胞获得率及贴壁结果均较其他二组为优.与未冻存细胞相比,复苏的细胞活力保持在95%以上.复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异.结论脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞,混合酶消化法消化效果最佳,经体外培养扩增后,可提供足够数量及纯度的内皮细胞.冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力,能及时提供制备组织工程学血管的种子细胞来源.     

混合生物人工肝细胞成分的初步研究：——乳猪肝细胞的分离 …

目的 为探讨乳猪肝细胞分离、体外培养的条件及其生长方式。方法 用两步灌注结合胶原酶消化法分离乳猪肝细胞,用激光条件培养基进行体外培养,ＥＤＴＡ消化传代,测定细胞的活性,观察其生长方式,群体倍增时间及蛋白质和ＤＮＡ的合成。结果 在 原酶浓度为０．０７５％,细胞的收获笔成活率较高,原代和传代的肝细胞生长良好,原代肝细胞倍增时间较短,ＤＮＡ和蛋白质的合成也较活跃,与传代细胞相比,无明显差别（Ｐ〉０．０５     

杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞增殖影响的观察

目的探讨杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞Eca9706增殖的影响,为新疆杏资源和阿魏蘑菇的开发利用及食管癌的预防提供理论依据.方法采用体外细胞培养,以MTT、Bradford蛋白测定法观察不同浓度(0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL)的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞的细胞存活量、蛋白质含量的影响.结果 0.1g/mL的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞的生长及蛋白质合成有明显的抑制作用(P＜0.05),而未见其对大鼠正常肝细胞BRL细胞存活量及蛋白质合成有抑制作用(P＞0.05).结论 0.1g/mL的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对体外培养的食管癌细胞的生长有明显的抑制作用,且呈明显的时间-效应关系.