雷公藤单体T10对过氧化氢所致PC12细胞损伤的保护作用及其机制的研究

目的以过氧化氢(H2O2)为工具药,建立阿尔茨海默病(AD)的氧化应激模型。观察雷公藤内酯醇(T10)的保护作用并初步探讨其作用机制。方法用不同浓度(25、50、100、200μmol/L)的H2O2处理PC12细胞24h,100μmol/LH2O2处理PC12细胞不同时间(6、12、24及48h),建立细胞损伤模型。用1、10、30nmol/LT10预孵育PC12细胞12h后加入100μmol/LH2O2共同作用24h以探讨T10的保护作用。MTT法检测细胞存活率,化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量,并采用荧光素酶报告基因方法检测转录因子NF-κB转录活性以探讨T10作用机制。结果随着H2O2浓度增加或作用时间延长,PC12细胞MTT值逐渐降低,而LDH释放量逐渐增加。100μmol/LH2O2处理细胞24h,MTT值明显下降,LDH释放量增加。而1、10、30nmol/L的T10预孵育12h可明显减轻PC12细胞的损伤,提高MTT值并降低LDH释放量。100μmol/LH2O2作用4h可明显增加PC12细胞NF-κB的转录活性,而1、10、30nmol/L的T10预处理12h可显著拮抗NF-κB转录活性的升高。结论T10可以有效的拮抗H2O2对PC12细胞的氧化损伤,作用机制可能与其降低转录因子NF-κB的转录活性有关。     

芍药苷通过分子伴侣自噬通路保护PC12细胞

目的 研究芍药苷对PC12细胞的保护作用,并探讨其对分子伴侣自噬通路的影响.方法 环境毒素MPP＋诱导PC12细胞损伤,同时给予芍药苷进行干预,检测细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率及细胞凋亡率的变化,并检测分子伴侣自噬相关蛋白Lamp2a表达水平的变化.结果 MPP＋处理24h,PC12细胞的存活率降低,漏出至上清液中的LDH增多,细胞凋亡率明显升高.芍药苷（25μmol·L-1）显著提高了PC12细胞的存活率,减少了LDH的漏出,降低了细胞凋亡率.Western blot显示MPP＋导致Lamp2a的表达升高,芍药苷能够显著抑制Lamp2a的激活.结论 MPP＋导致PC12细胞损伤和分子伴侣自噬的过度激活,而芍药苷对PC12细胞具有明显的保护作用,并显著降低了分子伴侣自噬通路的活性.     

促红细胞生成素对Aβ25-35诱导神经细胞损伤的抗凋亡作用及其机制

目的探讨促红细胞生成素对Aβ25-35诱导AD细胞模型毒性的保护作用及其作用机制。方法对数生长期的PC12细胞分为3组:空白对照组、模型组、EPO预处理组。细胞培养24h后,EPO预处理组加入终浓度为25U/ml的EPO预处理8h,再与模型组同时加入终浓度为10μmol/L Aβ的25-35,继续培养48h,收集细胞进行检测。采用MTT比色法分析细胞存活率,PI(碘化丙啶)流式细胞仪检测凋亡,HE染色观察细胞凋亡的形态学改变,免疫印记检测细胞色素C表达。结果MTT显示EPO处理组细胞存活率明显高于模型组(P<0.05),并且中剂量存活率最高;凋亡率较模型组明显下降(P<0.05);HE染色显示EPO组细胞数量多,结构完整。Western blot显示:模型组胞浆Cyt-C表达最强,而EPO处理组有较弱的Cyt-C表达(P<0.05)。结论EPO可以提高细胞存活率,降低凋亡率,对Aβ25-35诱导神经细胞毒性起防护作用;其机制可能是抑制了细胞色素C从胞浆释放,进一步阻止PC12细胞凋亡。     

H2O2预处理通过上调14-3-3蛋白表达减轻MPP+对PC12细胞的毒性作用

目的 探讨H2O2预处理(HPP)1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP )诱导PC12细胞损伤的保护作用和可能的机制.方法 采用4甲基偶氮唑盐法(MTT法)、自动生化分析仪、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法及免疫印迹(western blot)技术分别检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞凋亡及14-3-3蛋白的表达.结果 H2O2预处理能够上调14-3-3蛋白表达,增加PC12细胞活力(MPP 组52.46%±6.15%,HPP MPP 组83.78%±5.84%),抑制LDH的活性[MPP 组(37.31±3.99)U/L,HPP MPP 组(12.49±2.26)U/L];抑制细胞凋亡(MPP 48.72%±6.68%,HPP MPP 组17.56%±5.21%).结论 H202预处理能减轻MPP 对PCI2细胞的毒性损伤作用,这种保护作用是通过上调14-3-3蛋白的表达实现的.     

槲皮素对氧化应激大鼠星形胶质细胞的保护作用

目的 研究槲皮素对氧化应激损伤后大鼠星形胶质细胞的保护作用. 方法 采用终浓度为2 mmol/L的H2O2作用于体外原代培养的大鼠胶质细胞6 h,以诱导氧化应激.实验分为正常对照组、H2O2组、槲皮素+H2O2组.不同浓度(0、50、100、200μmol/L)槲皮素预处理24h后,应用速率法和LIVE/DEAD检测试剂盒分别检测氧化应激胶质细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放率以及细胞存活率的变化. 结果 终浓度为2 mmol/L的H2O2作用6 h即可造成细胞损伤,LDH释放率由对照组的(3.89±1.89)%增至(90.27±2.68)%,较对照组明显增多,细胞存活率由对照组的(99.25±0.08)%降至(59.73%±9.92)%,较对照组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05).槲皮素预处理后细胞LDH释放率降低,50、100、200 μmol/L浓度的槲皮素组LDH释放率分别减少到(48.19±13.98)%、(27.81±9.33)%和(18.13±8.28)%,与H2O2组比较差异有统计学意义(P<0.05);槲皮素预处理同时能提高细胞存活率,50、100、200 μmol/L浓度的槲皮素组细胞存活率分别提高至(86.80±3.62)%、(88.32±5.77)%和(91.18±3.03)%,与H2O2组比较差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 槲皮素预处理对氧化应激大鼠胶质细胞有一定的保护作用.     

落新妇苷通过激活PI3K/AKT信号通路和抑制P38MAPK信号通路减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤

目的 研究落新妇苷对H2O2诱导的氧化应激损伤的PC12细胞影响。方法 将PC12细胞分为5组:对照组、H_2O_2组及不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)落新妇苷组。采用CCK8实验检测各组细胞的活力; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡实验检测各组细胞凋亡率; Western blot检测PI3K、AKT、Caspase3和P38蛋白及其磷酸化激活蛋白的表达水平。结果 与H_2O_2组相比,落新妇苷组细胞的活力显著提高,细胞凋亡率明显降低,活化的凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3表达水平降低,PI3K/AKT途径相关蛋白p-PI3K和p-AKT的表达水平升高,P38 MAPK途径重要蛋白p-P38的表达水平降低。结论 落新妇苷对H_2O_2诱导的氧化应激损伤的PC12细胞有明显保护作用;这种保护作用可能是通过激活PI3K/AKT信号通路及抑制P38MAPK信号通路实现的。     

EGCG对H2O2诱导BV2细胞氧化损伤保护作用机制的研究

目的探讨EGCG对H2O2诱导BV2细胞氧化损伤的保护作用机制。方法以200μmol/L H2O2制备BV2细胞氧化应激损伤模型,用CCK-8法检测不同浓度EGCG(0、1、5、10、20、40、80μmol/L)的保护作用,Ho-echst33258染色法检测细胞的凋亡,Western bloting法检测caspase-9蛋白的表达。结果 10及20μmol/L的EGCG组保护效果较明显;EGCG保护组的凋亡细胞显著少于无保护组;20μmol/L EGCG保护组的caspase-9蛋白表达较无保护组明显下调(P=0.03<0.05)。结论 10及20μmol/L浓度的EGCG对H2O2诱导的BV2细胞损伤模型有保护作用,其机制可能是通过减少caspase-9蛋白的表达,进而部分阻断caspase-9所介导的caspases级联反应,减少BV2细胞的凋亡。     

丹参川芎嗪注射液对Aβ损伤的PC12细胞保护作用及机制研究

目的 探讨丹参川芎嗪注射液对Aβ损伤的PC12细胞可能的保护作用及机制。方法 将PC12细胞分为5组:空白对照组(未加任何处理药物)、Aβ诱导组(20 μmol/L Aβ处理组)和预处理组(分别加入浓度为5 ml/L、10 ml/L、20 ml/L的丹参川芎嗪注射液孵育24 h后加20 μmol/L Aβ),通过CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察PC12细胞核的改变,荧光分光光度计测定LDH、SOD、GSH及caspase-3活性水平,免疫组织化学方法观察细胞色素C(Cyt-C)蛋白释放水平,Western Blot检测Bcl-2的表达水平。结果 丹参川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)预处理对Aβ诱导的PC12细胞损伤有较好的保护作用,其保护作用随着药物浓度的增加而增强。它能增加Aβ损伤的PC12细胞增殖活力,减少Aβ诱导的PC12细胞凋亡,降低细胞核凝聚现象,抑制Aβ损伤的PC12细胞LDH释放,增强SOD和GSH活性,促进Cyt-C在细胞内表达,降低caspase-3活性,促进Bcl-2的表达。结论 丹参川芎嗪注射液对Aβ诱导的PC12细胞损伤具有与线粒体通路相关的保护作用,其保护作用与它抑制细胞凋亡、抗氧化应激、维持线粒体正常功能、抑制caspase-3的激活、促进抗凋亡因子Bcl-2的表达有关。     

黄芩苷通过上调lncRNAH19表达来减轻MPP+诱导的PC12细胞神经毒性

目的 探讨黄芩苷是否通过上调长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)H19表达来减轻1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP⁺)诱导的PC12细胞神经毒性。方法 分别采用0.5、0.75、1、2 mmol/L MPP⁺和10、20、50和70 μmol/L黄芩苷作用PC12细胞,后续试验使用水平分别选择0.75 mmol/L MPP⁺和50 μmol/L黄芩苷; 以0.75 mmol/L MPP⁺损伤PC12细胞,体外模拟帕金森病,并加入黄芩苷; 采用四甲基偶氮唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)进行细胞活力测定,Annexin V-异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate isomer,FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双染法进行凋亡定量分析,蛋白质印迹分析(Western blot)检测Pro-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3,Cleaved-caspase-3,B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)蛋白和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的相对表达水平,实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)进行lncRNA H19的相对表达水平检测; 在PC12细胞中转染lncRNA H19小干扰RNA(lncRNA H19 siRNA,si-H19),并加入MPP⁺和黄芩苷,考察PC12细胞增殖、凋亡等变化。结果 与对照组比较,MPP⁺降低PC12细胞的存活率、Bcl-2蛋白、lncRNA H19相对表达水平,提高PC12细胞的凋亡率、Cleaved-caspase-3,Bax蛋白相对表达水平(P<0.05),而Pro-caspase-3蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)。与MPP⁺组比较,黄芩苷显著提高MPP⁺诱导的PC12细胞的存活率、Bcl-2蛋白、lncRNA H19相对表达水平,降低PC12细胞的凋亡率、Cleaved-caspase-3,Bax蛋白相对表达水平(P<0.05),而Pro-caspase-3蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)。转染si-H19后黄芩苷和MPP⁺诱导的PC12细胞的存活率、Bcl-2蛋白相对表达水平降低,PC12细胞的凋亡率、Cleaved-caspase-3,Bax蛋白相对表达水平升高(P<0.05),而Pro-caspase-3蛋白相对表达水平无明显变化(P>0.05)。结论 黄芩苷上调lncRNA H19表达,提高MPP⁺诱导的PC12细胞活力和降低其凋亡,减轻MPP⁺诱导的PC12细胞神经毒性。     

黄芩苷对AB25-35诱导人神经原母细胞瘤SH-SY5Y凋亡的保护作用

目的：探讨黄芩苷对Aβ诱导的神经细胞凋亡的保护作用,同时通过对诱导凋亡的关键因素综合分析阐明其作用机制。 方法：①实验方法及分组：正常对照组,神经元母细胞瘤SH-SY5Y无血清培养;模型组,模型组加终浓度为25μmol/L 的Aβ25-35处理24h;黄芩苷治疗组,黄芩苷预处理1h,再加终浓度为25μmol/L的 Aβ25-35处理24h,大剂量组采用100μM,小剂量组采用50μM。②实验评估：各实验组作用24小时后,收集细胞上清ELISA测定细胞NO、LDH分泌;MTT实验测定各组细胞存活率;流式细胞仪测定细胞凋亡及线粒体膜电位的改变;RT-PCR检测caspase-3的mRNA水平。 结果：MTT实验显示,Aβ25-35处理后SH-SY5Y细胞的存活率明显下降（p<0.01）,而黄芩苷各治疗组则显示出明显的保护作用（p＜0.05,p＜0.01）;细胞上清LDH活性测试显示,Aβ25-35组上清中的LDH明显升高（p＜0.01）;黄芩苷组各治疗组与模型组比差异显著（p＜0.05,p＜0.01）;比色法测定细胞上清中NO分泌显示,Aβ25-35处理后细胞NO分泌明显上升（31.64±1.96μM）,而黄芩苷各治疗组均能有效抑制NO的产生,黄芩苷100μM（9.43±0.63μM）,黄芩苷50μM（23.41±0.94μM）p＜0.01;流式细胞仪分别测定细胞凋亡率及线粒体膜电位,结果显示与正常对照组比较Aβ25-35明显诱导了细胞凋亡,同时线粒体膜电位也明显下降（p＜0.01）,而黄芩苷各治疗通过保护线粒体膜电位有效抑制了凋亡的发生发生;进一步的caspase-3mRNA表达测定中也显示黄芩苷各组均能明显抑制caspase-3的表达。 结论：本研究结果明确了黄芩苷能有效抑制Aβ25-35诱导的神经元细胞的调亡,在进一步机制研究中显示了黄芩苷同过抑制自由基损伤、调亡分子caspase-3的表达以及保护线粒体正常功能等凋亡发生的关键环节保护了神经元细胞。