Kv1.3通道在哮喘患者外周血T淋巴细胞中的表达及对Th2细胞因子的影响

目的：检测Kv1.3钾通道在哮喘患者外周血T淋巴细胞中的表达水平,研究Kv1.3钾通道阻滞剂对哮喘患者外周血T淋巴细胞增殖及产生Th2细胞因子的影响,从而探讨Kv1.3钾通道阻滞剂应用于治疗哮喘患者慢性气道炎症的可能。方法：分离哮喘患者及健康对照者的外周血T淋巴细胞,检测T细胞中Kv1.3钾通道的mRNA及蛋白水平,并检测Kv1.3钾通道抑制剂ShK对T细胞增殖及产生Th2细胞因子的作用。结果：哮喘患者外周血T淋巴细胞的Kv1.3水平较健康对照者明显增高,Kv1.3钾通道抑制剂ShK能明显抑制T淋巴细胞的增殖及产生Th2细胞因子的能力。结论：Kv1.3可能是哮喘患者T细胞参与气道炎症的形成及发展的重要蛋白。选择性阻断Kv1.3钾通道可能成为哮喘未来治疗的方向之一。     

Kvl.3通道在哮喘患者外周血T淋巴细胞中的表达及对Th2细胞因子的影响研究

【】目的：检测Kv1.3钾通道在哮喘患者外周血T淋巴细胞中的表达水平,研究Kv1.3钾通道阻滞剂对哮喘患者外周血T淋巴细胞增殖及产生Th2细胞因子的影响,从而探讨Kv1.3钾通道阻滞剂应用于治疗哮喘患者慢性气道炎症的可能。方法：分离哮喘患者及健康对照者的外周血T淋巴细胞,检测T细胞中Kv1.3钾通道的mRNA及蛋白水平,并检测Kv1.3钾通道抑制剂ShK对T细胞增殖及产生Th2细胞因子的作用。结果：哮喘患者外周血T淋巴细胞的Kv1.3水平较健康对照者明显增高,Kv1.3钾通道抑制剂ShK能明显抑制T淋巴细胞的增殖及产生Th2细胞因子的能力。结论：Kv1.3可能是哮喘患者T细胞参与气道炎症的形成及发展的重要蛋白。选择性阻断Kv1.3钾通道可能成为哮喘未来治疗的方向之一。     

慢性阻塞性肺疾病患者外周血T淋巴细胞Kv1.3通道表达及功能的研究

目的探讨Kv1.3钾通道阻滞剂应用于治疗慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)患者慢性气道炎症的可能。方法选取慢阻肺患者及健康对照者各50例,分离外周血T淋巴细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测T细胞中Kv1.3钾通道的mRNA及蛋白水平,CCK-8法检测Kv1.3钾通道抑制剂ShK对T细胞增殖的影响,实时荧光定量PCR法检测ShK对T细胞产生IL-2的作用。结果慢阻肺患者外周血T淋巴细胞的Kv1.3的mRNA水平及蛋白水平较健康对照者明显增高,Kv1.3钾通道抑制剂ShK能明显抑制T淋巴细胞的增殖及产生IL-2的能力。结论 Kv1.3可能是慢阻肺患者T细胞参与气道炎症的形成及发展的重要蛋白。选择性阻断Kv1.3钾通道可能成为慢阻肺未来治疗的方向之一。     

Jurkat细胞Kv1.3钾通道的基本电生理学特性及动力学特征

目的采用膜片钳技术记录Jurkat细胞膜的Kv1.3通道电流,分析通道的动力学特征,并体会成功记录的要领。方法选择T淋巴细胞性白血病Jurkat E6-1细胞系为研究对象,采用全细胞膜片钳记录方式记录Kv1.3电流,选择合适的刺激方案,分析通道的激活、失活和复活动力学特性。结果 Jurkat细胞的Kv1.3电流具有电压门控特性,并能被ShK(100pmol/L)选择性阻断。Kv1.3通道的激活时间常数(τact)、失活时间常数(τin)和复活时间常数(τrec)分别为τact=6.47±2.44ms,τin=622.49±93.90ms,τrec=6.141s。在胞内钙没有被螯合的条件下,Kv1.3通道电流常掺杂有中等电导钙激活钾通道KCa3.1电流。玻璃微电极的口径和电极内液是否含EGTA是能否记录到纯净Kv1.3电流的关键。结论 Jurkat细胞表达功能性Kv1.3通道,该通道呈现快速激活、缓慢失活和缓慢复活的动力学特征。记录Kv1.3通道须注意剔除KCa3.1电流的掺杂。该工作对研究T淋巴细胞Kv1.3通道的功能具有一定的借鉴意义。     

急性冠状动脉综合征患者淋巴细胞电压依赖性钾通道的变化

[郭丽芬,张存泰,吴杰等.中华心血管病杂志,2007,35(9):818～821]用全细胞膜片钳技术和Western印迹法,探讨急性冠状动脉综合征(ACS)患者外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道(Kv)电流及Kv1.3蛋白表达的变化。收集12例ACS患者和10例健康志愿者外周血淋巴细胞,采用膜片钳全细胞电流记录方法,记录淋巴细胞膜Kv的电流密度。用Western印迹法检测外周血淋巴细胞Kv1.3蛋白的表达。发现ACS患者淋巴细胞Kv的电流密度为(269±94)pA/pF,明显高于正常人[(191±64)pA/pF,P<0.01]。ACS组淋巴细胞膜电容为(2.3±0.7)pF,对照组为(2.2±0.5)pF,两组间差…     

K+v通道在缺氧性肺血管收缩中的作用研究

目的 探讨K+v通道在缺氧性肺血管收缩（HPV）中的作用。方法Wistar大鼠40只随机分为两组:常氧对照组和低氧组, 采用酶消化的方法获得单个肺动脉血管平滑肌细胞（PASMC）,将分离细胞经a-actin免疫组化鉴定为PASMC。采用膜片钳技术记录PASMC静息膜电位（Em）和电压门控性钾通道电流（Ikv）。细胞内灌流Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3抗体混合液（1：125）,探讨钾通道在HPV中的作用。结果 低氧组膜电位明显去极化,细胞内灌流Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3抗体混合液可显著抑制常氧对照组PASMC的Ikv,使Em去极化,细胞内灌流Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3抗体混合液对低氧组PASMC的Ikv和Em均无显著影响。结论Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv9.3可能是氧敏感型通道,并可能介导了缺氧性肺血管收缩。     

K~+v通道在缺氧性肺血管收缩中的作用

目的 探讨K+v通道在缺氧性肺血管收缩(HPV)中的作用.方法 Wistar大鼠40只随机分为两组:常氧对照组和低氧组,采用酶消化的方法获得单个肺动脉血管平滑肌细胞(PASMC),将分离细胞经a-actin免疫组化鉴定为PASMC.采用膜片钳技术记录PASMC静息膜电位(Em)和电压门控性钾通道电流(Ikv).细胞内灌流Kv1.2,Kv1.3,Kv1.5,Kv2.1,Kv9.3抗体混合液(1:125),探讨钾通道在HPV中的作用.结果 低氧组膜电位明显去极化,细胞内灌流Kv1.2,Kv1.3,Kv1.5,Kv2.1,Kv9.3抗体混合液可显著抑制常氧对照组PASMC的Ikv,使Em去极化,细胞内灌流Kv1.2,Kv1.3,Kv1.5,Kv2.1,Kv9.3抗体混合液对低氧组PASMC的Ikv和Em均无显著影响.结论 Kv1.2,Kv1.3,Kv1.5,Kv2.1,Kv9.3可能是氧敏感型通道,并可能介导了缺氧性肺血管收缩.     

探析Kv1.3通道阻断剂对动脉粥样硬化大鼠CD4+TEM细胞分化的影响

目的 :探讨分析特异性阻断Kv1.3通道对动脉粥样硬化(Antheresclerosis,AS)大鼠CD4+T淋巴细胞分化的影响。方法 :建立AS大鼠模型,应用特异性Kv1.3通道阻断剂Sh K-L5对其进行持续干预,检测大鼠脾脏CD4+T细胞Kv1.3通道的表达及TEM细胞亚群所占比例的变化。结果 :Sh K-L5可显著抑制AS大鼠CD4+T淋巴细胞Kv1.3通道表达的上调(1.653±0.461vs0.8445±0.221,P<0.001)。Sh K-L5可显著抑制AS大鼠CD4+T淋巴细胞TEM亚群比例的上升(93.38±2.319%vs 86.23±3.577%,P<0.05)。结论 :特异性阻断Kvl.3通道剂Sh K-L5可显著抑制AS大鼠CD4+T淋巴细胞向TEM细胞亚群分化。     

钾通道阻滞剂对多发性硬化患者CD4+T细胞CCR7及CD45RA表达的影响

目的 研究Kv1.3钾通道阻滞剂海葵毒素(SHK)阻滞多发性硬化(Ms)患者急性期髓鞘反应性CIM+T淋巴细胞上的Kv1.3钾通道后,细胞表型CCR7、CD45RA表达的变化与疾病的关系.方法 对15例急性期MS患者、15例INF-B-1b治疗缓解期MS患者和15名健康对照的不同状态下的CD4+T淋巴细胞进行CD3、CIM、CCR7、CD45RA的荧光抗体及同型对照标记,用四标流式细胞仪检测3组不同状态下细胞表型CCR7、CD45RA表达的变化.结果 MS急性期组CIM+T细胞以CCR7-CIM5RA-(TEM)表型为主,其变化与病情有明显相关性,髓鞘抗原刺激后此型所占比例明显增高(P＜0.05),初始细胞表型CCR7+CD45RA+减少(P＜0.05),钾通道阻滞剂SHK对Ms急件期患者髓鞘反应性CD4+TEM表型有明显抑制作用(P＜0.05).结论 检测CI4+TEM细胞表型可能对判断病情有一定临床意义,Kv1.3钾通道可能成为治疗MS的新靶点.     

淋巴细胞上钾离子通道及其调控

淋巴细胞膜上的钾离子通道,在淋巴细胞活化过程中发挥重要作用,是免疫功能调节的重要环节。淋巴细胞膜上的钾离子通道分为2类:电压门控式钾离子通道(Kv)和钙激活的钾离子通道(KCa)。Kv是维持细胞静息膜电位的主要承担者;Kv和KCa分别在细胞活化的启动和维持阶段发挥主要作用;Kv和Cl-通道共同调节细胞容积。对钾离子通道的调节有利于我们对淋巴细胞的发育、活化和增殖等多种生物学过程的进一步了解。     

蛋白激酶C对慢性吸烟大鼠支气管平滑肌细胞膜电压门控钾通道的作用

目的 探讨蛋白激酶C对慢性吸烟大鼠支气管平滑肌细胞（bronchial smooth muscle cells, BMSCs）膜电压门控钾通道（Kv通道）的作用,为慢性阻塞性肺疾病的防治提供理论依据。方法 建立大鼠的慢性吸烟模型。大鼠随机分为吸烟组（A组）和对照组（B组）。采用急性酶分离法获得单个大鼠的支气管平滑肌细胞。用全细胞膜片钳技术测定其膜电位和Kv通道电流。比较用蛋白激酶C激动剂12-佛波醇脂（PMA）和抑制剂GFX前后两组细胞Kv通道电流的不同变化。结果 慢性吸烟大鼠BSMC的静息膜电位和Kv通道电流明显低于对照组。PKC可抑制正常大鼠BSMC+50 mV刺激时的峰值Kv通道电流（从78.3±10.5 pA/pF 下降到50.4±8.6 pA/pF, n=10 cells, P<0.05）。该抑制作用可被GFX抵消（77.9±7.8 pA/pF vs 70.4±9.6 pA/pF, n=10 cells, P>0.05）。但是PKC对慢性吸烟大鼠的BSMC的Kv通道电流无抑制作用（58.3±7.6 pA/pF vs 56.4±6.3 pA/pF, n=10 cells, P>0.05）。结论 慢性吸烟可抑制大鼠BMSC膜电压门控钾通道（Kv通道）的电流。PKC活化后对正常大鼠的BSMC有抑制作用,但对慢性吸烟大鼠的BSMC则无抑制作用。 【关键词】吸烟 支气管 钾通道     

动脉粥样硬化患者CD4~+CD25~+调节性T细胞上Kv1.3通道的活性变化

目的探讨动脉粥样硬化性心血管疾病(ACVD)患者CD4~+CD25~+调节性T细胞(Tregs)的Kv1.3通道活性与该疾病的关系,并验证依普利酮(EPL)对动脉血管粥样硬化有逆转作用。方法收集ACVD患者(n=70)及正常人志愿者(n=20)全血样本。免疫磁珠分选外周血CD4~+CD25~+Tregs,CCK-8技术检测ELP对CD4~+CD25~+ Tregs增殖抑制的影响。分组进行培养:正常人外周血的Control组、ACVD患者外周血组(ACVD组)、ACVD患者+EPL组(ACVD+EPL组)。RT-qPCR检测各组培养体系中的Kv1.3(钾通道)、KCa3.1(钙通道)和内质网钙释放激活的钙通道(CRAC)基因的表达;In-cell western blotting技术检测CD4~+CD25~+ Tregs的Kv1.3通道蛋白质水平的表达。结果 EPL的最适浓度为30μmol; ACVD组Kv1.3通道的mRNA和蛋白质的表达分别是正常对照组3.35倍和1.83倍(P0.01),ACVD+EPL组Kv1.3通道的mRNA和蛋白质的相对表达分别是ACVD组62.09%(P0.01);ACVD组KCa 3.1和CRAC通道mRNA的表达分别是正常对照组的2.18、2.22倍(P0.01),ACVD+EPL组KCa 3.1和CRAC通道mRNA的表达是ACVD组的61.01%、76.68%(P0.01)。结论 CD4~+CD25~+ Treg细胞的三种离子通道在ACVD中均有高表达,EPL可抑制Kv1.3通道的活性,推测醛固酮受体拮抗剂可能通过抑制CD4~+CD25~+ Tregs上的Kv1.3通道的激活,抑制了T淋巴细胞的活性,以抑制动脉粥样硬化病变中炎症作用的发生发展。     

Kv1.1及Kv1.3通道亚型对小鼠肠系膜微细动脉的调节作用

目的 研究Kv1.1及Kv1.3通道亚型对小鼠肠系膜微细血管的调节作用.方法 以健康6～8周C57BL/6雄性小鼠肠系膜微细动脉作为研究对象,应用丹麦DMT520A离体微血管张力测定系统记录血管张力变化.应用广谱电压依赖性钾通道(Kv)阻断剂4-AP,Kv1.3通道选择性阻断剂PAP-1,Kv1.1通道选择性阻断剂TEA分别作用于静息状态,KCl及NE预收缩动脉,记录血管张力变化情况.应用Kv通道阻断剂4-AP,Kv1.3通道选择性阻断剂PAP-1作用于血管,观察Kv及Kv1.3通道在0 mmol/L Ca2+及2 mmol/L Ca2+ K-H液中对NE收缩曲线的作用.结果 Kv通道阻断剂4-AP可引起静息状态的血管收缩,并进一步收缩KCl预收缩的血管,但浓度依赖性舒张NE预收缩的动脉,并且与对照组相比,4-AP能明显抑制NE在0 mmol/L Ca2+液中所致的血管收缩[(3.45-±0.24)mN vs(0.11±0.02) mN,P＜0.01].Kv1.3通道选择性阻断剂PAP-1未能收缩静息状态的血管,但可使KCl预收缩的血管发生轻微舒张反应,却明显舒张NE预收缩的动脉,而且PAP-1既可抑制NE在0 mmol/L Ca2+ K-H液中所致的血管收缩[对照组vs PAP-1组:(4.28 ±0.53)mN vs(2.75 ±0.49)mN,P＜0.05],又可抑制在2 mmol/L Ca2+液中的收缩张力[对照组vsPAP-1组:(7.08 ±0.58)mN vs(5.90 ±0.80)mN,P＜0.05].Kv1.1通道选择性阻断剂TEA可引起静息状态的血管收缩,但在0 mmol/L Ca2+液中该作用消失,同时对KCl或NE预收缩的动脉均无明显作用.结论 Kv通道可调节小鼠肠系膜动脉的舒缩反应.其中Kv1.1通道主要发挥血管收缩调节作用,可能与促进血管平滑肌细胞外钙内流有关,而Kv1.3通道主要发挥血管舒张调节作用,可能同时抑制平滑肌细胞内钙释放和细胞外钙内流.     

电压门控性钾通道与三叉神经痛

电压门控性钾通道维持神经元静息膜电位,参与细胞兴奋性的改变。在三叉神经痛发病过程中,三叉神经节神经元作为初级感觉神经元,在痛觉的传导和传递过程中起重要作用。电压门控性钾通道的多种类型在三叉神经节神经元中均有表达,激活时产生不同类型的钾电流。电压门控性钾通道功能的改变,及其与多种神经递质、炎性介质和受体间的相互作用,在三叉神经痛的发病过程中起到了重要作用。     

K+v通道亚型在急性缺氧性肺血管收缩中的作用研究

目的 探讨K+v通道亚型在急性缺氧性肺血管收缩(HPV)中的作用.方法 Wistar大鼠30只随机分为两组:常氧对照组和低氧组,采用酶消化的方法 获得单个肺动脉血管平滑肌细胞(PASMC).将分离细胞经a-actin免疫组化鉴定为PASMC细胞.采用膜片钳技术记录PASMC静息膜电位(Em)和电压门控性钾通道电流(Ikv).细胞内灌流Kvl.2、Kvl.3、Kvl.5、Kv2.1抗体混合液(1:125),探讨钾通道在HPV中的作用.结果 低氧组膜电位明显去极化,细胞内灌流Kvl.2、Kvl.3、Kvl.5、Kv2.1抗体混合液可显著抑制常氧对照组PASMC的Ikv,使Em去极化,细胞内灌流Kvl.2、Kvl.3、Kvl.5、Kv2.1抗体混合液对低氧组PASMC的Ikv和Em均无显著影响.结论 Kvl.2、Kvl.3、Kvl.5、Kv2.1可能是氧敏感型通道,并可能介导了急性缺氧性肺血管收缩.     

糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的研究

[目的]研究糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的变化,探讨糖尿病神经系统的退化机制。[方法]用全细胞膜片钳技术记录糖尿病大鼠海马神经元Na 电流的变化。[结果]糖尿病大鼠海马神经元电压门控钠离子通道的Na 电流I-V曲线明显上移。[结论]糖尿病大鼠海马神经元钠离子通道Na 电流水平下降。     

尾核神经元的原代培养及离子通道特性的研究

  目的 建立一种稳定的大鼠尾核神经元的分离和体外培养方法,用于中枢神经元离子通道特性的研究。方法 自新生24 h内的Wistar乳鼠大脑中分离出尾核,结合酶消化及机械吹打分离尾核神经元,进行体外原代神经元培养。采用全细胞膜片钳技术记录电压门控钠通道电流和电压门控钾通道（Kv）电流。结果 分离出的神经元形态正常,细胞膜光滑有弹性,保存了主要离子通道的活性。结论 本方法适合用于中枢神经系统神经元离子通道的研究。     

良性家族性婴儿惊厥KCNQ2基因G271V突变体钾通道的功能研究

目的 观察良性家族性婴儿惊厥相关基因KCNQ2突变体G271V的钾通道的功能,进一步探讨KCNQ2基因G271V突变的致病机理。方法 将前期成功构建的突变体G271V或和Kv7.2及Kv7.3的真核表达载体转染进真核表达细胞（HEK293细胞）,利用全细胞膜片钳技术检测G271V突变体的钾通道功能。结果 转染HEK293细胞后,G271V突变体无电流产生,与野生型相比,激活电流明显下降,诱导电压门控去极化改变。G271V的最大激活电流密度为(2.47±0.41) pA/pF（n=12）,Kv7.2的最大激活电流密度为(20.53±2.51) pA/pF（n=10）,差异有统计学意义（Pn=15）,Kv7.2/G271V/Kv7.3的最大激活电流密度为(42.71±6.27) pA/pF（n=10）,而G271V/Kv7.3的最大激活电流密度为(3.74±0.76) pA/pF（n=10）,差异有统计学意义（P<0.05）,突变体引起Kv7.2/G271V/Kv7.3异源通道电流减少约50%。结论 G271V突变体不能使钾通道开放去极化钾电流,突变体引起钾通道功能缺陷。     

Kv1.3钾通道调节人脐静脉内皮细胞 LOX-1受体摄取oxLDL

目的 观察Kv1.3钾通道在LOX-1摄取oxLDL中的作用,并探讨其机制。方法 分别以慢病毒载体shRNA-Kv1.3-LV3-pGLV-h1-GFP-puro和Kv1.3-LV5-EF1a-GFP-Puro转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以获得HUVECs细胞中下调和上调表达Kv1.3蛋白。利用全细胞膜片钳技术记录Kv1.3蛋白过表达和下调的HUVECs Kv1.3 I/V曲线。以oxLDL与HUVECs共孵育后,分别应用免疫比色法和Fluo-3/AM荧光标记法测定细胞内胆固醇和钙离子相对含量。经Western blot法测定Kv1.3、LOX-1、p38、p38磷酸化水平。结果 shRNA950转染组HUVECs Kv1.3 mRNA和蛋白表达量较空白对照组显著降低(P<0.05),过表达转染组Kv1.3 mRNA和蛋白表达量较空白对照组显著升高(P<0.05)。Kv1.3表达上调后, I/V曲线上移,该效应可被奎尼丁抑制;Kv1.3表达下调后,I/V曲线下移。Kv1.3过表达组胆固醇相对水平明显高于对照组(P<0.05),shRNA950+oxLDL组胆固醇的相对含量低于oxLDL组(P<0.05)。Western blot法检测显示,Kv1.3过表达组的LOX-1蛋白表达量较对照组升高(P<0.05),Kv1.3敲低组的LOX-1蛋白水平较对照组减低(P<0.05);Kv1.3过表达组磷酸化p38与p38蛋白水平的比值高于对照组二者的比值(P<0.05),Kv1.3敲低组磷酸化p38与p38蛋白表达量的比值低于对照组两者的比值(P<0.05)。结论 Kv1.3钾通道经p38信号通路参与调节HUVECs LOX-1受体摄取oxLDL。该研究为阐明LOX-1结合oxLDL的电荷依赖性机制增添了新的实验依据。     

三叉神经节细胞电压门控通道研究中的钙电流振荡活动

目的 :探讨三叉神经节细胞电压门控性钙通道电流特性。方法 :在急性分离的三叉神经节细胞膜上 ,阻断电压门控性延迟整流钾通道和电压门控性钠通道 ,在 - 70mV的钳制电位下 ,给予 1 0mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激 ,进行全细胞膜片钳记录。结果 :在仅阻断电压门控性延迟整流钾通道时 ,- 1 0mV的去极化脉冲刺激激活了三叉神经节细胞膜上继快钠电流之后的慢内向电流 ,呈重复开闭的振荡特性 ;同时阻断电压门控性延迟整流钾通道和电压门控性钠通道 ,在 - 2 0mV的去极化脉冲刺下 ,也可记录到呈振荡特性的慢内向电流。振荡电流可被细胞外喷射的 1mmol·L-1 尼福地平所阻断。结论 :三叉神经节细胞膜上高电压激活的重复开闭慢内向电流可能为电压门控性钙电流 ,其振荡特性可能与感觉信息中枢传入的初级加工有关。