Survivin启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的了解Survivin启动子在HepG2肝癌细胞与3T3细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并评价其驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的能力。方法以pGL3-surp340质粒为模板,扩增Survivin340启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail。将重组质粒分别转染HepG2肝癌细胞和3T3细胞,通过Western Blot检测两种细胞中Trail蛋白表达的差异。利用流式细胞术检测HepG2肝癌细胞及3T3细胞转染重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail后细胞凋亡的情况。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,转染HepG2和3T3两种细胞后,通过Western Blot检测,HepG2肝癌细胞Trail蛋白表达的相对灰度值为0.49±0.43,较3T3细胞Trail蛋白表达(0.15±0.37)明显增强(P0.05)。利用流式细胞术检测,HepG2肝癌细胞转染重组质粒组的凋亡率(%)为11.59±0.74,空白质粒组为3.45±0.52,未转染组为2.67±0.34;3T3细胞重组质粒组的凋亡率(%)为3.26±0.24,空白质粒组3.16±0.15,未转染组2.83±0.27。HepG2细胞转染重组质粒组凋亡率明显高于其他对照组(P0.05)。结论含Survivin基因启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活蛋白2结合蛋白1基因的克隆及其反式调节基因的筛选

目的 克隆HBV前S1蛋白反式激活蛋白2结合蛋白1(PS1TP2BP1)基因,并筛选与其相互作用的反式激活基因.方法 应用聚合酶链反应(PCR)扩增PS1TP2BP1基因,鉴定正确后再将其亚克隆到真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His A上;以真核表达质粒pcDNATM3.1/mycHis A-PS1TP2BP1转染HepG2细胞,构建cDNA消减文库;进行测序及同源性分析.结果 从HepG2细胞来源的cDNA中扩增出PS1TP2BP1基因,并成功进行TA克隆,酶切、测序均正确后,成功构建真核表达重组体.消减文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到15个含200～1000 bp插入片段的菌落.对所得片段测序,并进行间源性分析,显示15种已知基因编码蛋白可能是PS1TP2BP1反式激活靶基因.结论 成功克隆PS1TP2BP1,并构建了PS1TP2BP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础.     

丙型肝炎病毒1b基因型核心蛋白对HepG2细胞Bax与Bcl-2基因表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）1b基因型核心蛋白（C）对HepG2细胞B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）与Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达的影响,以探索1b型HCV C蛋白与HepG2细胞凋亡的关系。方法利用RT-PCR扩增出HCV-1b-C基因,经双酶切后连接pcDNA3.1（-）,成功构建真核表达载体pcDNA3.1（-）/HCV-1b-C。利用脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR及Western Blot检测其mRNA及蛋白的表达,RT-PCR及Western Blot检测转染成功后HCV-1b-C对HepG2细胞Bax与Bcl-2表达的影响,并设转染空质粒组及未处理组作对照。结果成功构建真核表达载体pcDNA3.1（-）/HCV-1b-C;瞬时转染HepG2细胞,成功表达HCV C mRNA及蛋白;转染C基因组的Bax的mRNA及蛋白相对表达量减少,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）;转染C基因组的Bcl-2的mRNA及蛋白相对表达量增多,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 1b基因型HCV C蛋白转染HepG2细胞会导致Bax表达减少及Bcl-2表达增多,降低Bax/Bcl-2比值,可能是抑制HepG2细胞凋亡的机制之一。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响

目的　研究丙型肝炎病毒核心区 (HCV C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。方法　首先运用基因重组技术构建含有HCV C基因的真核表达质粒pcDNA3.1( ) ,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2 ,经G4 18筛选获得稳定转染HepG2细胞 (HCV C转染HepG2细胞 ) ,经逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV C蛋白表达。然后进行如下实验 :( 1)利用四甲基偶氮唑蓝比色 (MTT)法检测HCV C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率 ;经流式细胞术(FACS)检测 3组细胞的细胞周期 ;( 2 )经流式细胞术检测细胞凋亡率 ;( 3)经端粒重复扩增 酶联免疫吸附试验 (TRAP ELISA)法检测上述 3组细胞端粒酶活性表达情况。结果　 ( 1)HCV C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率 ;HCV C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率 ;( 2 )HCV C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV C转染细胞凋亡率 ;( 3)上述 3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性。结论　 ( 1)HCV C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用 ;( 2 )HCV C蛋白促进HepG2从G0 /1期进入S期 ,从而可能促进细胞生长增殖 ,抑制细胞凋亡 ;( 3)HCV     

缺氧诱导因子1α对肝癌细胞HepG2干细胞特性及表阿霉素敏感性的影响

目的探讨缺氧诱导因子(HIF)1α对肝癌细胞HepG2干细胞特性及表阿霉素敏感性的影响。方法以肝癌细胞为研究对象,肝癌细胞HepG2脂质体转染过表达HIF-1α的质粒作为实验组,转染pcDNA3.1空质粒作为对照组,单独HepG2细胞为HepG2组。实时荧光定量PCR检测HIF-1αmRNA表达,Western Blot检测HIF-1α蛋白表达;流式细胞术检测细胞表面CD133表达。不同浓度表阿霉素(0、6.25、12.5、25、50μmol/L)作用3组细胞24 h,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测表阿霉素(50μmol/L)处理后细胞凋亡情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用t检验。结果相较于HepG2组及对照组,实验组HIF-1αmRNA的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P值均<0.001);Western Blot结果显示实验组HIF-1α蛋白高表达。HepG2组、对照组和实验组细胞的CD133比例分别为0.040%±0.003%、0.030%±0.010%、20.110%±0.600%,实验组的CD133阳性率显著高于HepG2组和对照组(P值均<0.001)。表阿霉素浓度为25、50μmol/L时,HepG2组和对照组的细胞活性明显受到抑制,显著低于实验组(P值均<0.05)。50μmol/L表阿霉素作用48 h后,实验组的细胞凋亡率(67.9%±2.5%)较HepG2组(93.6%±1.5%)和对照组(93.0%±1.2%)明显降低(P值均<0.001)。结论过表达HIF-1α的质粒成功转染至HepG2细胞,HIF-1α可提高肝癌细胞干细胞比例使其对表阿霉素耐药。     

细胞内基质金属蛋白酶2基因过表达对INS-1细胞功能的影响

目的探讨细胞内基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因过表达对大鼠胰岛β细胞株INS-1细胞功能的影响。方法采用基因重组技术将大鼠MMP-2cDNA插入真核表达载体pcDNA 3.1(+)构建大鼠MMP-2真核表达质粒,培养INS-1细胞。随机分为正常对照组,空质粒转染组及MMP-2质粒转染组。脂质体Lipofectmine 2000转染INS-1细胞,观察INS-1细胞内MMP-2基因和蛋白表达量变化,MMP-2酶活性变化,以及INS-1细胞凋亡情况与胰岛素分泌功能的变化。结果与正常对照组、空质粒转染组比较,MMP-2质粒转染组MMP-2mRNA表达增加(P均0.05),蛋白表达水平和酶活性上调(P均0.05);MMP-2质粒转染组细胞凋亡率(56.07±3.68)%高于正常对照组(33.70±6.53)%及空质粒转染组(38.02±5.60)%(P0.05),而IRI(1.30±0.27)低于正常对照组(3.37±0.76)与空质粒转染组(2.90±0.84)(P0.05)。结论细胞内MMP-2基因的过表达可引起胰岛β细胞凋亡增加,胰岛素分泌功能下降。     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.     

p15~(INK4B)基因对人胰腺癌细胞系BxPC3增殖的影响

目的 探讨p15~(INK4B)(p15)基因转染对人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖的影响.方法 采用脂质体将pCDNA3.1(+)-p15质粒及阴性对照pCDNA3.1(+)-neo质粒转染BxPC3细胞,以亲本细胞作为对照组.应用RT-PCR检测细胞p15 mRNA表达;Western blotting检测细胞p15蛋白表达;MTT法检测细胞增殖;透射电镜观察细胞超微结构变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率.结果 p15转染组细胞恢复p15 mRNA和蛋白表达.培养第2天生长被抑制,至第7天,生长抑制率达47.9%.G_0/G_1期细胞占(61.56±3.96)%,显著高于空质粒转染组的(47.44±6.35)%和对照组的(49.22±7.23)%(P<0.05).出现明显的G,凋亡峰,细胞凋亡率为(5.27±1.04)%,显著高于空质粒转染组的(0.11±0.06)%和对照组的(0.09±0.07)%(P<0.05).透射电镜观察到p15转染组发生细胞凋亡.结论 体外p15基因转染可以抑制人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖,并能诱导其凋亡.     

乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白表达对肝癌细胞免疫逃逸的影响及其机制

目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)表达对肝癌细胞免疫逃逸的影响及其机制。方法:免疫印迹法检测人正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞HepG2中HBXIP、CD46和CD59蛋白的表达;将HepG2细胞分为pSilencer组(转染pSilencer质粒)、pSilencer-HBXIP组(转染pSilencer-HBXIP质粒)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1质粒)和pcDNA3.1-HBXIP组(转染pcDNA3.1-HBXIP质粒),台盼蓝法检测HBXIP对补体介导的细胞毒作用,免疫印迹法检测转染后各组细胞中CD46、CD59、p-IκB表达,检测NF-κB信号通路抑制剂PDTC作用pSilencer-HBXIP组和pcDNA3.1-HBXIP组细胞后CD46、CD59的表达情况。结果:HBXIP、CD46和CD59蛋白在HepG2细胞中的表达水平显著高于HL-7702细胞(P0.05);pcDNA3.1-HBXIP组细胞的补体介导的细胞毒作用显著低于pcDNA3.1组(P0.05),而pSilencer-HBXIP组细胞的补体介导的细胞毒作用明显高于pSilencer组(P0.05)。与pSilencer组相比,pSilencer-HBXIP组中CD46、CD59蛋白的表达和IκB的磷酸化水平均显著受到抑制(P均0.05),而pcDNA3.1-HBXIP组细胞中CD46、CD59蛋白的表达和IκB的磷酸化水平较pcDNA3.1组均显著上调(P均0.05)。NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理后,pSilencer-HBXIP组和pcDNA3.1-HBXIP组细胞中CD46和CD59蛋白的相对表达量均显著下调(P均0.05)。结论:HBXIP在HepG2细胞中高表达,且正向调控膜结合补体调节蛋白CD46、CD59的表达,减弱补体介导的细胞毒作用,进而发生免疫逃逸,其作用机制可能与HBXIP介导NF-κB信号通路调控CD46、CD59蛋白的表达有关。     

KISS-1基因对人食管鳞癌细胞EC-9706的MMP-2表达影响

目的观察KISS-1基因对食管癌细胞EC-9706中基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达的影响。方法将EC-9706细胞分为A、B、C组,A、B组加入pcDNA3.1-KISS-1质粒、pcDNA3.1空质粒进行转染,C组不予处理。分别采用Western blot、RT-PCR法检测细胞中的MMP-2蛋白及mRNA。结果A组KISS-1蛋白为1.143±0.118,MMP-2蛋白为0.737±0.115,B组分别为0.752±0.113、0.985±0.178,C组分别为0.761±0.127、1.038±0.233,A组与B、C组比较,P均〈0.05。A组KISS-1 mRNA为0.892±0.166,MMP-2 mRNA为0.685±0.104,B组分别为0.679±0.141、0.808±0.057,C组分别为0.686±0.148、0.815±0.073,A组与B、C组比较,P均〈0.05。结论KISS-1基因对人食管鳞癌细胞EC-9706中MMP-2的表达具有抑制作用。     

人硫氧还蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人硫氧还蛋白基因的重组真核表达载体。方法人硫氧还蛋白的cDNA克隆至pGEM-TEasy载体,经DNA测序证明后,将其克隆至真核表达载体pShttle构建重组pShttle-hTRX,pShttle-hTRX转染Hela细胞系进行瞬时表达,通过Westernblot、免疫组化、活性测定、酶切、PCR扩增等方法证实构建载体的正确性。结果构建携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体pShttle-hTRX,转染HeLa细胞后可检测到hTRX的转录和表达。结论正确构建了携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体,本结果可用于探讨硫氧还蛋白的生物学作用。     

Construction and expression of recombined human AFP eukaryotic expression vector

AIM: To construct a recombined human AFP eukaryotic expression vector for the purpose of gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: The full length AFP-cDNA of prokaryotic vector was digested, and subcloned to the multi-clony sites of the eukaryotic vector. The constructed vector was confirmed by enzymes digestion and electrophoresis, and the product expressed was detected by electrochemiluminescence and immunofluorescence methods. RESULTS: The full length AFP-cDNA successfully cloned to the eukaryotic vector through electrophoresis, 0.9723 IU/ml AFP antigen was detected in the supernatant of AFP-CHO by electrochemiluminescence method. Compared with the control groups, the differences were significant (P<0.05). AFP antigen molecule was observed in the plasma of AFP-CHO by immunofluorescence staining. CONCLUSION: The recombined human AFP eukaryotic expression vector can express in CHO cell line. It provides experimental data for gene therapy and target therapy of hepatocellular carcinoma.     

人FUT3基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表选.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达,为其临床应用奠定基础。方法以RT—PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列,定向克隆至载体pEGFP—N1中构建质粒pEGFP—CCR7,采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导人肺腺癌A549细胞中,加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞,并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP—CCR7构建正确,荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株;本研究为临床应用提供了实验依据。     

Structure and expression of human dihydropteridine reductase.

Dihydropteridine reductase (DHPR; EC 1.6.99.7) catalyzes the NADH-mediated reduction of quinonoid dihydrobiopterin and is an essential component of the pterin-dependent aromatic amino acid hydroxylating systems. A cDNA for human DHPR was isolated from a human liver cDNA library in the vector lambda gt11 using a monospecific antibody against sheep DHPR. The nucleic acid sequence and amino acid sequence of human DHPR were determined from a full-length clone. A 112 amino acid sequence of sheep DHPR was obtained by sequencing purified sheep DHPR. This sequence is highly homologous to the predicted amino acid sequence of the human protein. Gene transfer of the recombinant human DHPR into COS cells leads to expression of DHPR enzymatic activity. These results indicate that the cDNA clone identified by antibody screening is an authentic and full-length cDNA for human DHPR.