丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术（bioinformatics)，克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5AWll，新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt)，编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因，研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术，以HCV NS5A表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP9，在GenBank中注册，注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt)，编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成，并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆，为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白HS5A反式激活基因HS5ATP6的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒PcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的KOZ2ak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。结果 从HePG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP6，在GenBatk中注册，注册号为AF529367。Ns5ATP6基因的编码序列全长为1572个核苷酸(nt)，编码产物由524个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP6的筛选与克隆，为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因. 方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)- NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低. 结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9.6倍,pCAT3-TXNRD1p的2.1倍.本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCV NS5A蛋白反式激活TXNRD1基因转录作用的结果.结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP1，已在GenBank中注册，注册号为AYll6969。NS3评1基因的编码序列全长为1932个核昔酸(nt)，编码产物由眺个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13 蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCV NS5ATP13表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5ATPl3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCV-NS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个白色克隆，进行菌落PCR分析，其中96个均得到100～1000bp插入片段。挑取40个插入片段测序分析，其中2个cDNA片段为未知序列，通过生物信息学分析获得其全长序列，已被GenBank收录，另有34个为已知功能序列。结论成功筛选出2个新的cDNA序列，并获得其全长序列，可能为HCV NS5ATPl3蛋白反式激活相关靶基因。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4的克隆化研究

目的 探索丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白反式激活作用的新的靶基因，以有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 应用表达谱芯片分析等分子生物学技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术，筛选、克隆HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3-core，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3-core转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆核心蛋白反式激活的新型靶基因，命名为HCTP4，新基因的编码基因序列全长为220个核苷酸(nt)，编码产物由748个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV核心蛋白是具有反式激活作用的蛋白。DNA微短阵技术(DNA mieroarray)是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因，此新基因的发现为深入研究HCV核心蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCV NSSA表达质粒peDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行SSH分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对，进行电子拼接。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。结果 结果从HepG2细胞提取总RNA，多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，测序证实，命名为NSSATP8在GenBank中注册，注册号为．AF529369.NSSATP8基因的编码序列全长为1449(nt)，编码产物由483个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV NS5A反式激活新型靶基因NSSATP8筛选与克隆，进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列，对其可能的氨基酸序列进行分析比较，并对其基因利用多聚酶链反应技术(PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现，为阐明HCVV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

Cloning and identification of NS5ATP2 gene and its spliced variant transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A

AIM: To clone, identify and study new NS5ATP2 gene and its spliced variant transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A. METHODS: On the basis of subtractive cDNA library of genes transactivated by NS5A protein of hepatitis C virus, the coding sequence of new gene and its spliced variant were obtained by bioinformatics method. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted to amplify NS5ATP2 gene. RESULTS: The coding sequence of a new gene and its spliced variant were cloned and identified successfully. CONCLUSION: A new gene has been recognized as the new target transactivated by HCV NS5A protein. These results brought some new clues for studying the biological functions of new genes and pathogenesis of the viral proteins.