反义血管内皮生长因子腺病毒基因感染对类风湿关节炎滑膜细胞VEGF基因转录的影响

目的 观察反义血管内皮生长因子(VEGF)165腺病毒对滑膜细胞VEGF基因转录的影响。方法 将反义VEGF165腺病毒转染滑膜细胞，通过Northern-blot的方法检测其对VEGF的基因转录的影响。结果 Northem杂交结果显示：反义基因转染滑膜细胞3d后，VEGF165基因的转录即受到明显抑制，4d抑制更加明显，5d后几乎检测不出阳性杂交信号。结论 反义VEGF165腺病毒感染滑膜细胞后可以阻断VEGF基因的转录过程，从而抑制VEGF蛋白质的翻译和表达。     

重组腺病毒介导的反义血管内皮生长因子对胰腺癌细胞生长的抑制作用

目的：构建表达反义VEGF165的重组腺病毒，探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性。方法：应用基因重组技术，将513bp的人VEGF165cDNA反向克隆到腺病毒粘粒载体pAxCAwt的SwaI酶切位点。重组粘粒与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染263细胞，制备出表达反义VEGF165的重组腺病毒。建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型，瘤体内直接注射重组腺病毒，观察肿瘤的生长及血管生成情况。结果：成功构建了反义VEGF165腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF，并制备出高滴度的反义VEGF165重组腺病毒，注入胰腺癌瘤体内后，治疗组肿瘤生长速度比对照组明显减慢（P＜0．01），治疗组肿瘤微血管密度也明显减少（P＜0．01）。结论：反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤生长，有潜在的应用价值。     

VEGF、IL-6在类风湿关节炎发病中的作用研究进展

类风湿关节炎（RA）是一类病因尚未明确的以关节滑膜炎为主要病变的慢性自身免疫性疾病,它可以导致骨和软骨的侵蚀破坏,最后造成关节畸形.随着分子生物学和免疫学技术的研究进展,发现滑膜细胞和淋巴细胞可以产生大量的细胞因子,其中IL-6可诱导滑膜细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）,VEGF可提高血管通透性,促使炎性细胞渗出.血管形成和炎症反应是两个相互依赖的过程,这些因子之间相互调节,形成一个复杂的网络,促进了RA的发生和发展[1].     

RA患者血清VEGF水平变化及与腕关节滑膜血流参数的相关性研究

目的研究超声检测类风湿关节炎（RA）患者腕关节滑膜血流参数结合血清血管内皮细胞生长因子（VEGF）水平检测判断疾病活动性的可行性。方法研究对象为62例治疗前RA患者（RA组）和30例健康志愿者（对照组）,两组均采用ELISA法检测血清VEGF水平,RA组同时采用超声检查双侧腕关节滑膜血流分级、滑膜动脉阻力指数（RI）;采用Spearman法对滑膜血流分级、RI与血清VEGF水平的相关性进行分析。结果RA组血清VEGF水平明显高于对照组（P〈0．01）;RA组滑膜血流分级及R1分别与血清VEGF水平呈显著正相关和负相关,r=0．903、-0．817（P均〈0．01）。结论超声检测RA患者腕关节滑膜血流参数结合血清VEGF水平检测可反映疾病活动性,此对RA的临床诊治及疗效评估、预后判断具有重要指导意义。     

重组腺病毒介导的反义血管内皮生长因子对胰腺癌细胞生长的抑制作用

目的构建表达反义VEGF165的重组腺病毒,探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性.方法应用基因重组技术,将513 bp的人VEGF1 65 cDNA反向克隆到腺病毒粘粒载体pAxCAwt的Swa I酶切位点.重组粘粒与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染293细胞,制备出表达反义VEGF165的重组腺病毒.建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型,瘤体内直接注射重组腺病毒,观察肿瘤的生长及血管生成情况.结果成功构建了反义VEGF165腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF,并制备出高滴度的反义VEGF165重组腺病毒,注入胰腺癌瘤体内后,治疗组肿瘤生长速度比对照组明显减慢(P＜0.01),治疗组肿瘤微血管密度也明显减少(P＜0.01).结论反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤生长,有潜在的应用价值.     

血管内皮生长因子反义核酸治疗裸鼠皮下种植胰腺癌

目的:探讨抗血管生成基因转染治疗胰腺癌的可行性. 方法:构建反向插入VEGF165cDNA的复制缺陷型腺病毒载体,体外转染SW1990细胞,MTT法检测重组腺病毒转染对细胞生长的影响.Northern blot和ELISA检测转染前后SW1990细胞VEGF的mRNA水平和蛋白表达.裸鼠皮下种植瘤瘤体内注射重组腺病毒,CD31染色观察反义VEGF重组腺病毒转染对裸鼠种植瘤微血管密度和肿瘤生长速度的影响. 结果:重组腺病毒体外转染并不影响SW1990细胞的生长速度.Northern blot和ELISA检测在mRNA水平和蛋白水平证实反义VEGF重组腺病毒转染对体外培养的SW1990细胞内源性VEGF表达有明显的下调作用.体内实验表明反义VEGF重组腺病毒转染可减少肿瘤内微血管数量,肿瘤生长受到抑制. 结论:反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长,为抗血管生成的基因治疗奠定了基础.     

VEGF与TGF-β1在胶原诱导的RA大鼠滑膜组织中的表达及意义

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子（TGF）-β1在类风湿关节炎（RA）发病中的作用,为RA的靶点治疗提供依据。方法采用皮下多点注射牛Ⅱ型胶原方法对18只Wistar大鼠建立RA模型（实验组）,同时选择10只Wistar大鼠皮下注射等量生理盐水作对照组,实验28d处死大鼠、收集滑膜组织,用免疫组化法检测两组VEGF蛋白与TGF-β1蛋白表达,RT—PCR技术检测VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA水平。结果VEGF蛋白及TGF-β1蛋白阳性染色均主要位于滑膜衬里层和滑膜下层的滑膜细胞及血管内皮细胞,实验组滑膜VEGF、TGF-β1蛋白及mRNA表达均显著高于对照组（P均〈0．01）;VEGF mRNA与TGF-β1 mRNA表达呈正相关,r=0．481（P〈0．05）。结论VEGF和TGF-β1在RA滑膜增生、浸润及关节破坏中起协同作用,以两者为靶点的药物有望为RA治疗提供新思路。     

Etanercept抑制BNX鼠-人RA移植物嵌合体模型中的滑膜增生和软骨侵蚀及降解

目的观察肿瘤坏死因子（TNF）-α拮抗剂Etanercept能否抑制类风湿关节炎（RA）的滑膜增生和软骨破坏，并探讨作用机制。方法将人RA滑膜和正常关节软骨移植到BNX小鼠皮下构建BNX鼠-人RA移植物嵌合体模型，造模4周后给予Etanercept（100μg）皮下注射，连续4周，对照组给予注射用水。评价移植物中的滑膜增生、滑膜细胞对软骨的侵蚀和软骨细胞周围软骨降解的组织学积分，并检测血清TNF-α含量，滑膜的TNF-α和人血管内皮生长因子（VEGF）的表达以及滑膜细胞凋亡情况。结果与对照组比较．Etanercept组中滑膜增生、软骨侵蚀、软骨降解积分以及血清TNF-α含量均显著降低：滑膜细胞的TNF-α和VEGF表达水平也显著下降。但滑膜细胞凋亡程度差异无统计学意义。结论Etanercept能抑制嵌合体模型中的滑膜增生和软骨侵蚀及降解。其作用机制除了中和滑膜组织和血液中的TNF-α外．还可能与下调滑膜细胞的VEGF表达有关。     

白芍总苷对类风湿关节炎滑膜细胞增殖及分泌作用的研究

【摘要】目的研究白芍总苷（TGP）对类风湿关节炎（RA）患者滑膜细胞增殖和分泌细胞因子的影响及作用机制。方法TGP作用于体外培养的RA患者膝关节滑膜细胞，并以骨关节炎（OA）患者为对照。四甲基偶氮唑蓝（mrr）法比较细胞增殖，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清液中自细胞介素（IL）一1B、肿瘤坏死因子（TNF）一0【浓度变化。结果TGP浓度分别在2．5la,g／ml和12．5la,g／ml时对RA和OA抑制作用最强．而在其高浓度时反而对细胞增殖有促进作用。TGP对RA的抑制率显著高于其对OA的抑制。12．5la,g／ml的TGP对RA滑膜细胞分泌IL一1的水平有显著性的抑制作用，但对0A滑膜细胞无明显抑制作用。结论TGP对RA患者滑膜细胞异常增殖和分泌炎性因子均有抑制作用，并均优于其对OA的作用。提示TGP通过调节细胞增殖和细胞因子分泌而起到治疗作用。     

VEGF反义寡核苷酸抑制人膀胱癌细胞VEGF表达的作用和效果

目的　观察 VEGF反义寡核苷酸对膀胱癌细胞 VEGF表达的抑制情况。方法　采用免疫组化法观察反义寡核苷酸对膀胱癌细胞VEGF表达的影响 ,并观察条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用。结果　 VEGF反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的 VEGF表达有明显的抑制作用。结论　 VEGF反义寡核苷酸能够抑制膀胱癌细胞的 VEGF表达 ,故对临床膀胱癌抗血管生成的治疗极具潜力和应用前景。     

人BMP2及VEGF双基因共表达腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

目的 构建人骨形态发生蛋白2（BMP2）与血管内皮生长因子（VEGF）双基因腺病毒穿梭质粒。方法 对pCU-CAGGS-hVEGF165的目的基因亚克隆并引入新的酶切位点,定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,将质粒pcDNA3．1-BMP2及pIRES酶切后,将BMP2和IRES片段定向连入pShuttle-CMV-hVEGF165,构建可同时表达两个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-hBMP2-IRES-hVEGF165,进行酶切分析及序列测定。结果 酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确。结论 成功构建了BMP2及VEGF双基因腺病毒穿梭质粒;为联合基因治疗骨缺损的研究奠定了基础。     

Gene therapy that inhibits nuclear translocation of nuclear factor kappaB results in tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis of human synovial fibroblasts

OBJECTIVE: Tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) increases the survival and proliferation of human rheumatoid arthritis (RA) cell lines. These experiments were designed to determine if inhibition of nuclear factor kappaB (NF-kappaB) nuclear translocation leads to increased apoptosis of TNFalpha-treated human RA cell lines. METHODS: We constructed an inhibitor of nuclear factor kappaB(IkappaB) dominant-negative adenovirus (AdCMVIkappaB-DN) and an X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) antisense adenovirus (AdCMVXIAP-AS). Primary RA synovial fibroblast (RASF) cell lines were transfected in vitro, and SV40-transformed RA synovial cell lines in SCID mice were transfected in vivo. Cells were treated with TNFalpha and analyzed for apoptosis. RESULTS: There was no apoptosis of primary RASF transfected in vitro with AdCMVIkappaB-DN alone. In contrast, there was apoptosis of >85% of cells treated with AdCMVIkappaB-DN plus TNFalpha. Primary RASF in SCID mice also exhibited high levels of apoptosis after in vivo transfection with AdCMVIkappaB-DN followed by treatment with TNFalpha. There was no apoptosis after treatment with AdCMVIkappaB-DN in the absence of TNFalpha. XIAP is an inhibitor of apoptosis which was up-regulated by TNFalpha, and this up-regulation was inhibited by AdCMVIkappaB-DN plus TNFalpha. Transfection of an AdCMVXIAP-AS gene therapy resulted in increased TNFa-induced apoptosis. CONCLUSION: AdCMVIkappaB-DN gene therapy greatly enhances apoptosis due to inhibition of an NF-kappaB-mediated antiapoptosis signaling pathway, and XIAP is a TNFalpha-inducible specific inhibitor of apoptosis in RA synovial cell lines. This and other modulators of TNF receptor or the Fas apoptosis pathway may be therapeutically beneficial in facilitating apoptosis of synovial tissue in patients with RA.     

重组腺病毒介导反义2型基质金属蛋白酶抑制人肝癌细胞株浸润的实验研究

目的构建携带反义2型基质金属蛋白酶(MMP2)的重组腺病毒并探讨它对人肝癌细胞株HepG2侵袭细胞基底膜的抑制作用。方法从新鲜肝癌组织中提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应法合成MMP2cDNA序列中5'端转录起始位点附近长约500bp的基因片段,将此片段反义克隆到腺病毒载体系统的多克隆位点,经转染293细胞包装生成携带反义MMP2基因的重组腺病毒Ad-MMP2AS;利用侵袭小室模型,检测Ad-MMP2AS对肝癌细胞株(HepG2细胞)体外侵袭能力的影响。结果成功构建并生成携带反义MMP2基因片段的重组腺病毒Ad-MMP2AS,病毒滴度达1×108;体外细胞实验中Ad-MMP2AS能明显抑制HepG2细胞穿透人工重组基底膜的能力。结论重组腺病毒介导反义MMP2基因可望有效抑制肝癌细胞的浸润和转移,为肝细胞癌的基因治疗提供新的方法。     

Ad-VEGF165转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究

目的研究经腺病毒介导的人血管内皮生长因子165（VEGF165）转基因细胞修饰的再生丝素膜（SF）诱导血管形成活性及其分子机制。方法将WI-38人胚肺成纤维细胞分别培养在有（SFC组）或无（PBS组）再生丝素膜的24孔培养板上,24h后用带绿色荧光蛋白（GFP）基因的空载体腺病毒Ad-GFP（Ad-GFP组/SFCG组）或含有VEGF165目的基因的重组腺病毒Ad-VEGF165（Ad-VEGF165组/SFCV组）感染培养细胞。通过形态学观察和ELISA法检测各组细胞培养上清液中VEGF165目的基因表达及其对细胞自分泌的血管生成素-1（Ang-1）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、血小板衍化生长因子（PDGF）表达的影响,并用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和在兔眼角膜上进行新生血管诱导实验。结果形态学观察发现WI-38细胞在再生丝素膜上不仅贴壁生长良好,而且易被Ad-GFP、Ad-VEGF165腺病毒感染,呈现强荧光。再生丝素膜利于Ad-VEGF165组中VEGF165目的基因在细胞中的高表达（P〈0.05）,而且还可使细胞自分泌的Ang-1表达水平明显升高（P〈0.05）,同时可维持细胞自分泌的FGF2及PDGF稳定表达。Ad-VEGF165组（SFCV组）具有促进CAM上血管生长活性和诱导兔眼角膜组织新生血管生成作用。结论 Ad-VEGF165感染WI-38成纤维细胞所修饰的再生丝素膜,具有诱导血管新生的功能。     

VEGF在类风湿关节炎滑液中的表达及上调MMP-2活性的研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在类风湿关节炎(RA)患者关节滑液中的表达及其上调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性在RA关节损伤机制中的意义。方法采用免疫印迹法、酶联免疫吸附试验、明胶酶谱电泳分析法及侵袭小室法,观察RA患者组及对照组关节滑液单个核细胞中VEGF及受体KDR的表达,单个核细胞上清液中VEGF的水平,VEGF与KDR阳性的单个核细胞体外共培养前后上清中MMP-2的活性及细胞侵袭力的变化。结果VEGF及KDR在滑液单个核细胞高表达；共培养后MMP-2的活性及细胞的侵袭力明显增强。结论VEGF与受体KDR结合促使RA滑液单个核细胞MMP-2活性上调及细胞侵袭力的增强,促进受损关节软骨及骨的降解破坏。     

Modulation of adenovirus infection in vitro by antisense oligodeoxynucleotides

OBJECTIVE: Antisense oligodeoxynucleotides (ODNs) may represent a novel, airway directed approach to the treatment of adenovirus infection of the lung, for which no specific therapy exists. This study assessed the efficacy of antisense ODNs in modulating adenovirus infection in vitro. METHODOLOGY: A biological assay, which quantified viral plaque formation by wild type adenovirus 5 in a lung epithelial cell line (A549), was used to evaluate the inhibitory effect of a number of antisense ODNs targeted to the early (E) 1 A and protein IX genes of adenovirus 5. Antisense ODNs (20-21mers, phosphorothioate end-protected) were designed to straddle the initiation of translation (AUG) codon of the mRNA of the targeted gene. RESULTS: There was a consistent and significant (P < 0.005) reduction in viral plaque formation in those cells treated with an E1A antisense ODN, compared with the nonsense control ODN. Neither the addition of a cationic lipid (Lipofectamine), nor increasing the concentration of ODN from 1 micro mol to 15 micro mol enhanced the original inhibitory effect observed with the E1A antisense ODN. CONCLUSIONS: An antisense ODN targeted to the E1A gene can specifically inhibit adenovirus 5 infection in vitro, suggesting a potential therapeutic role for antisense ODNs in adenovirus infection of the lung.     

大鼠ANT1基因腺病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠线粒体蛋白ANT1基因的腺病毒载体,并检测其在体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达.方法 将大鼠线粒体膜蛋白腺(嘌呤核)苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)1基因片段克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV上,在细菌中将穿梭质粒和pAdXsi载体进行重组,经脂质体转染HEK293细胞对重组腺病毒包装、扩增,用其感染体外培养的VSMC.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,荧光显微镜观察转染效率.用Western印迹检测转染后ANT1在VSMC中的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果表明ANT1基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达2×1011 pfu/ml,Western印迹检测ANT1在VSMC中表达明显高于对照组(P<0.05).结论 成功构建了含大鼠ANT1基因的重组腺病毒载体并在VSMCs有效表达,为以后将Ad-ANT1应用于VSMCs凋亡的研究奠定了基础.