脱钙骨基质材料的生物学表现：降解性能、孔隙率及其黏附性能特征

目的：体外观察脱钙骨基质的降解性能及孔隙率,同时采用兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质在体外复合培养,了解兔骨髓间充质干细胞对这种天然材料的黏附能力. 方法：实验于2005-01-08/03-15在兰州大学骨科研究所进行.取6月龄的青紫蓝兔1只,麻醉后处死,取四肢骨干骺端及椎体松质骨,采用Urist提供的方法制作脱钙骨基质,将脱钙骨基质置于磷酸盐缓冲溶液中12周测定其降解率;用液体置换法测其孔隙率;用细胞计量法测定生长良好的浓度为1×10^8L^-1的第3代骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质复合培养6 h后的黏附率. 结果：脱钙骨基质的降解随时间的延长逐渐加速,8周前,其降解速率较慢,8周后,其降解速度明显加快,完全降解需要10～12周,与骨髓间充质干细胞的增殖规律近似;所测脱钙骨基质孔隙率为（77.15±3.44）%;1×10^8L^-1的第3代骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均黏附率为71.25%. 结论：脱钙骨基质的降解曲线与骨髓间充质干细胞的增殖曲线相一致,具备良好的孔隙率和黏附率,提示脱钙骨基质可能为软骨组织工程比较理想的生物支架材料.     

同种异体脱钙骨基质的组织工程学特性

背景:由骨衍生的支架材料无论形态学和力学特征,具有合成材料无可比拟的优势,脱钙骨基质具有和自体骨最接近的三维结构,同时以Ⅰ型胶原为主,胶原是细胞黏附和生长的良好支架.目的:从组织工程学角度研究同种异体脱钙骨基质的生物学特性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性.方法:据Urist描述的方法制备青紫蓝兔同种异体脱钙骨基质,扫描电镜观察脱钙骨基质的超微结构,测定其孔径、孔隙率和降解率,测定同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞的黏附率,兔体内植入法评价同种异体脱钙骨基质的组织相容性.结果与结论:脱钙骨基质呈多孔海绵状三维结构,孔径在210-320 um之间,孔隙率为92%,体外降解12周降解率达90%以上,脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(51.50±2.30)%,(94.13±2.14)%和(87.24±1.75)%.兔体内植入6周后脱钙骨基质周围界面未引起明显的炎症和排斥反应,并形成软骨样结构和少量骨组织.说明脱钙骨基质具有适宜的三维多孔结构,降解时间和软骨形成时间同步,同种异体脱钙骨基质与种子细胞黏附率高,与细胞组织相容性好,能满足软骨组织工程对支架材料的要求,是理想的软骨组织工程的支架材料.     

同种异体脱钙松质骨基质材料复合自体骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损

背景：到目前为止，还没有一种十分有效的方法治疗关节软骨缺损。许多治疗方法都只能缓解临床症状，而不能有效促进软骨的再生，也不能恢复软骨表面的承重功能。目的：观察脱钙骨基质复合骨髓间充质干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效。设计、时间及地点：随机对照动物实验，分别于2005—01／03在兰州大学第二医院骨科研究所和2008-05／08在桂林医学院中心实验室完成。材料：取新西兰兔四肢骨干骺端及椎体松质骨，脱钙制备脱钙松质骨基质材料；体外分离培养同种新西兰兔骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨基质支架上体外培养。36只新西兰兔随机分成骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨填充组（简称复合组）、同种异体脱钙骨填充组及空白对照组，每组12只。方法：在髁间窝髌面上用直径4mm的钻头钻孔深约3mm造成膝关节全层软骨缺损模型。复合组双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入脱钙骨基质吸附体外分离培养的自体骨髓间充质干细胞复合物；同种异体脱钙骨填充组单纯植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。主要观察指标：分别于植入后4，8，12周取材进行组织学及免疫组化染色观察，根据关节软骨组织学计分标准进行评分。结果：36只新西兰兔均进入结果分析。复合组所修复组织为透明软骨样修复：而同种异体脱钙骨填充组和空白对照组为纤维性修复。植入后12周复合组大体评分及组织学评分明显低于同种异体脱钙骨填充组和空白对照组（P〈0．05）；同种异体脱钙骨填充组低于空白对照组（P〈0．05）。结论：运用软骨组织工程的原理，以脱钙骨基质为支架材料的自体骨髓间充质干细胞移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法。     

异种生物衍生骨支架材料的制备及性能

背景：异种骨来源丰富,价格低廉,处理相对简单容易,处理后骨支架保留原有骨的微结构,具有良好的促成骨、骨传导及骨诱导活性。目的：检测自制生物衍生骨支架材料的理化性质及体外细胞相容性。方法：通过脱蛋白、脱脂、脱钙,深低温冻存制备猪源性松质骨支架材料。组织学检测松质骨处理前后的变化,扫描电镜观察材料结构及计算孔隙直径,采用液体置换法检测支架材料的孔隙率,体外降解速度,能谱分析及体外复合兔骨髓间充质干细胞的细胞相容性。结果与结论：处理后的松质骨支架材料具有三维多孔结构,孔隙直径150.8-306.7μm,孔隙率84.5%-89.7%。材料在前6周降解速度稍慢,6周后材料降解率曲线基本呈线性且降解速度明显加快,10周时材料接近完全降解,降解率达92.8%。松质骨支架材料孔隙大小适合骨髓间充质干细胞的黏附和增殖。表明生物衍生骨支架材料性能良好,细胞相容性良好,适用于构建组织工程骨。     

脱钙松质骨的骨支架材料制备及其生物学检测

背景:脱钙松质骨的主要成分是胶原,由于其良好的三维空间及促进细胞增殖分化的生长因子,使其具有传导成骨和诱导成骨的双重功能,但是目前没有修订出一个规范科学的制备流程.目的:采用新方法制备兔脱钙松质骨,并检测其孔隙率、降解率及其生物相容性,对其能否作为组织工程的支架材料进行评估.方法:在Urist方法的基础上采用新方法制备新西兰兔脱钙松质骨,并对脱钙松质骨的空隙率、体外降解率、以及细胞活力和诱导骨髓间充质干细胞成骨能力进行检测.实验分为脱钙3 h,脱钙24 h和脱钙48 h组,其他的处理步骤3组都相同.结果与结论:脱钙3,24,48 h组的孔隙率分别为76.56%,81.25%,84.38%.完全降解所需时间分别为64,59,53 d.细胞在种植后1～3 d为生长滞留期,第5天达到对数生长期,以后进入到平台期.诱导后的骨髓间充质干细胞行碱性磷酸酶染色呈阳性.结果提示,新方法制备的脱钙松质骨对细胞无毒害作用,在生物学特性上达到骨组织工程支架材料的要求.     

兔骨髓基质干细胞在不同脱钙程度骨基质材料上的增殖

背景:脱钙骨基质具有天然网状孔隙结构,有较好的可塑性和生物相容性,但目前报道对制备脱钙骨基质所用的脱钙时间各异.目的:比较不同脱钙时间的脱钙骨基质对兔骨髓基质干细胞增殖的影响,为组织工程软骨筛选最佳支架材料.方法:取兔髂骨制成条块状,经反复脱脂后,分别脱钙处理6,12,24 h,乙醇浸泡2 d制得脱钙骨基质,置于24孔培养板中.取浓度为5×10~9L~(-1)的第3代兔骨髓基质干细胞悬液40 μL,接种于上述培养板不同脱钙时间的预湿材料上.扫描电镜下观察脱钙骨基质形态及其孔隙率、孔径,MTT法测定骨髓基质干细胞在脱钙骨基质上的增殖情况,扫描电镜下观察骨髓基质干细胞在脱钙骨基质上的黏附情况.结果与结论:脱钙骨基质呈天然的高密度孔隙网架结构,骨小梁、小梁间隙和骨内管腔系统同时存在,脱钙6,12,24 h的脱钙骨基质其孔隙率、孔径大小无明显差异(P>0.05).与脱钙12,24 h的脱钙骨基质比较,骨髓基质干细胞与脱钙6 h的脱钙骨基质复合更为紧密,细胞相容性最好.扫描电镜下,脱钙6 h的脱钙骨基质上生长的骨髓基质干细胞培养8 d后增殖稳定,适合移植,且细胞数量明显多于脱钙12,24 h的脱钙骨基质(P<0.01).     

低强度脉冲式超声对兔脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞复合体的影响

背景:有关低强度脉冲式超声波促进关节软骨损伤修复的研究较多,可供选择的细胞支架亦较多,但是有关低强度脉冲式超声波的应用条件及构建出理想的组织工程软骨细胞支架尚未达到共识.目的:构建新西兰兔同种异体脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的复合体.给予一定条件的低强度脉冲式超声波刺激,以探讨脱细胞脱钙骨基质作为组织工程软骨支架的可行性和低强度脉冲式超声波刺激对关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的促进作用.设计、时间及地点:多个样本观察,实验于2009-05/08在解放军第二军医大学生物医学工程研究所完成.材料:应用新型改良Urist法制备兔脱细胞脱钙骨基质.采用机械粉碎结合酶消化法获取兔关节软骨细胞;采用全骨髓漂洗法分离出骨髓间充质干细胞并加以纯化,进行体外单层培养扩增.方法:按与脱细胞脱钙骨基质复合的细胞成分不同及是否应用低强度脉冲式超声波刺激不同分为4组:软骨细胞组、骨髓间充质干细胞组、复合细胞组:脱细胞脱钙骨基质分别与软骨细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合,未进行低强度脉冲式超声波刺激.超声组:将脱细胞脱钙骨基质与软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合,第2天进行低强度脉冲式超声波刺激,刺激频率1.0 MHz、瞬时空间强度10 mW/cm~2,20 min/d.主要观察指标:①平面培养第2代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞行免疫组织化学检测.②新型改良Urlet法制备的脱细胞脱钙骨基质行苏木精一伊红染色.③于细胞-支架复合第21天行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测.结果:①平面培养第2代关节软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,可见细胞形态为多角形、星形、圆形,有伪足伸出,胞质内容丰富,胞浆明显呈棕黄色,胞核为圆形.②平面培养第2代骨髓间充质干细胞的CD34免疫组织化学染色呈阴性,CD44及CD105免疫组织化学染色呈阳性.③新型改良Urist法制备的兔脱细胞脱钙骨基质内未见明显的细胞样结构,空隙大小均匀.④复合第21天后,骨髓间充质干细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,软骨细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色弱阳性,复合细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,超声组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性.结论:①第1-3代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞与原代细胞的生物学性能相似.②在脱细胞脱钙骨基质内,软骨细胞和骨髓间充质干细胞可以保持较高的增殖能力.③10 mW/cm~2的低强度脉冲式超声波不影响骨髓间充质干细胞活性,并且能够加速其向关节软骨细胞分化,但未发现有明显促进细胞增殖的作用.     

完全脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程纤维软骨

背景:含有骨形态发生蛋白的完全脱钙骨基质可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化并维持其软骨细胞的特性,在软骨发生过程中发挥重要作用.目的:将骨髓间充质干细胞与完全脱钙骨基质在体外诱导培养成纤维软骨组织以及观察培养体系与支架材料对细胞凋亡的影响.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞,取第1代骨髓间充质干细胞均匀接种到完全脱钙骨基质上,以含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子、地塞米松、抗坏血酸及体积分数10%FBS的高糖DMEM诱导培养液培养作为实验组,将单层诱导培养、单层基础培养的骨髓间充质干细胞、空白完全脱钙骨基质作为对照,于培养第1,2,3,4周进行大体形态观察以及Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的RT-PCR定性检测;培养4周进行细胞凋亡检测.结果与结论:实验组可检测到Ⅰ型胶原的持续表达,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖表达逐渐增加.单层诱导培养组可检测到Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达及Ⅰ型胶原的持续表达,但表达量远低于实验组;实验组细胞凋亡率高于单层诱导培养组、单层基础培养组.说明转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导培养的骨髓间充质干细胞-完全脱钙骨基质可以表达特异性软骨基质,三维环境培养细胞外基质的表达量明显高于单层诱导培养;静态培养系统对三维培养的细胞凋亡有影响.     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景:用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论.鉴于此,课题组提出"同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨"的实验设技.目的:同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法.方法:分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组:实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子.比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况.制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养.分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析.结果与结论:实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01).实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞.组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性.提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨.同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求.     

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性

目的:组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路,但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求.探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性,并评价修复效果.方法:实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成.①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞,观察细胞的增殖和基质合成,绘制细胞生长曲线.②将细胞终浓度为3x 108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨摹质的24孔培养板中进行接种培养2,4,6 d,计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率.③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型,随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组,每组18只.实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞;脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质;空白对照组不作任何植入.移植术后6,12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测.结果:54只青紫兰兔均进入结果分析.①共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖加快.脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(46.50±1.40)%,(93.25±2.89)%和(88.34±0.76)%.②大体观察结果:实验组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固.脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复.③组织学评分:实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组,差异具有显著性意义(P＜0.01),脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好.结论:自体骨髓问充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞,骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,可节省大量的软骨细胞,与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损.     

纳米晶胶原基骨修复材料与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养

背景:纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求.目的:观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度.设计、时间及地点:体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成.材料:健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄.纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供.方法:体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养.主要观察指标:①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线.②复合培养5,10 d后扫描电镜观察二者复合程度.③复合培养5,10 d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量.结果:兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10 d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5 d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P<0.01).结论:兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高.     

兔骨髓基质干细胞与软骨细胞混和培养体内成软骨

背景:诱导因子及软骨微环境是影响骨髓基质干细胞成软骨分化及软骨形成的主要因素.目的:利用少量软骨细胞以共培养方式诱导骨髓基质干细胞体内成软骨.设计、时间及地点:2004-09/2005-03在解放军第四军医大学口腔医院病理教研室完成的随机对照动物实验.材料:选择清洁级新西兰兔15只用于细胞支架复合物的种植,随机分为混合细胞组、软骨细胞组、骨髓基质干细胞组,5只/组.取新生1～3 d龄新西兰兔5只用于骨髓基质干细胞、软骨细胞的分离培养.聚羟基乙酸无纺网支架为上海易括公司产品,材料直径15 μm,平均间距150～200 μm,孔隙率97%,厚2 mm.方法:混合细胞组将骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混匀,调整细胞密度为6.0×1010 L-1,接种于经培养液预湿的塑形聚羟基乙酸 5 mm×5 mm的支架上,然后在复合物周围滴加含胎牛血清的DMEM液培养1周.软骨细胞组、骨髓基质干细胞组的细胞密度调整为6.0×1010 L-1后同法接种于支架上.各组兔麻醉后于背部一侧皮下组织植入对应的细胞-支架复合物.主要观察指标:植入后第8周行新生软骨大体观察和苏木精-伊红、Masson三色染色.结果:各组细胞与聚羟基乙酸支架黏附情况良好.植入8周后,混和培养组和软骨细胞组均形成了成熟的软骨样组织,并基本保持复合物初始的大小和形状,两组新生软骨外观及组织学特征较接近.骨髓基质干细胞组在体内培养过程中未形成软骨组织,而是形成了纤维结缔组织.结论:骨髓基质干细胞与软骨细胞按3:1混合形成的微环境,能有效诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,并促进骨髓基质干细胞的体内成软骨.     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景:新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性?目的:评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成.选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002).实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供.方法:①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测.②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架.③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性. 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定.②纳米材料及细胞复合2,4,8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况.③细胞对材料黏附率的测定.④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力.结果:①细胞表面抗原标志检测结果:CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%.②细胞与材料相容情况:扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通.应用质量法测得的孔隙率为85%～90%,孔径为50～300 μm,平均150 μm.骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d,细胞呈球形散在分布;4 d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表面锚靠;8 d时细胞增殖,相互间融合,并有大量的细胞外基质分泌,大部分材料颗粒被覆盖.③细胞对材料黏附率:细胞-支架复合物共培养2及6 h,骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架.④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较:纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%,细胞周期G0-G1为90.81%,G2-M为0.52%,S为8.66%,G2/G1为1.81.单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%,细胞周期G0-G1为87.14%,G2-M为9.69%,S为4.16%,G2/G1为1.80.结论:纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性,可用来做组织工程生物材料.     

聚磷酸钙纤维/明胶软骨组织工程支架复合材料的制备及性能表征

背景:目前,以明胶为基体制备的组织工程支架材料存在力学性能低,生物相窖性差缺陷,其降解速率也难以控制.目的:希望研制一种以明胶为基体材料,降解速率可以控制旦具有良好的为学性能和生物相容性能的高空隙率软骨组织工程支架材料. 设计、时间及地点:单一样本观察,实验于:2006-06/2008-06在兰州交通大学工程材料研究所完成.材料:明胶,聚磷酸钙纤维(直径10-20μm),松香(颗粒尺寸为355-450μm),方法:选用自制聚磷酸钙纤维为增强材料,明胶为基体材料.采用溶媒浇铸、粒子滤取技术,制备出聚磷酸钙纤维/明胶组织工程支架复合材料. 主要观察指标:测试该支架复合材料的微观结构、物理性能、力学性能和降解特性.结果:①微观结构:该支架复合材料具有三维、连通、微孔结构,孔隙分布较均匀.②物理力学性能:聚磷酸钙纤维,明胶支架复合材料密度的实验值和计算值基本相吻合;孔隙率的实验值均在60%-80%,基本满足组织工程支架复合材料的空隙率要求.压缩模量随交联剂质量浓度的增加而增大.③降解性能:在0-2周内,支架复合材料的降解速率较大,2周以后,降解速率趋于平缓,随交联剂质量浓度的增大而减小,降解液的pH值基本保持在5-7之间.结论:聚磷酸钙纤维/明胶复合材料的物理力学性能和降解性能基本满足软骨组织工程支架材料的要求,该复合材料有希望成为软骨组织工程支架材料之一.     

羟基丁酸-羟基辛酸一体化骨软骨支架的体外血管化

背景：前期实验构建的羟基丁酸-羟基辛酸共聚体一体化骨软骨支架具备良好的生物相容性、生物可降解性，并且降解产物无毒性。 目的：将兔肾微血管内皮细胞与羟基丁酸-羟基辛酸一体化骨软骨支架复合培养，观察支架骨层血管化效果。方法：运用溶剂浇铸-颗粒沥滤法，制备具有骨层/骨与软骨界面层/软骨层3层结构的羟基丁酸-羟基辛酸一体化骨软骨支架。将传代培养至第3代的兔肾微血管内皮细胞，接种到一体化骨软骨支架骨层支架上，MTT法检测细胞在支架上的增殖活性，10 d后苏木精-伊红染色及电镜观察细胞在支架内的生长状况。 结果与结论：一体化骨软骨支架外观具备明显的3层结构，各层之间连接紧密，骨层疏松多孔，各层支架孔隙均匀且相通，一体化支架孔隙率为78%。兔肾微血管内皮细胞在支架上分裂增殖良好，复合培养10 d后，细胞在骨层支架内呈立体生长，中间界面层内未发现细胞，苏木精-伊红染色可见细胞黏附生长于骨层支架孔隙间，细胞依附支架的多孔结构生长，形成管腔样结构，但细胞并未长入中间界面层。     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景:目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。目的:观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。方法:采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果与结论:胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100～150μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

Preclinical and clinical data for the use of mesenchymal stem cells in articular cartilage tissue engineering

Introduction: With an ageing population, the prevalence of osteoarthritis (OA) has increased. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have been proposed to be an attractive alternative candidate in the tissue engineering of articular cartilage primarily due to its abundant source, reduced cartilage donor site morbidity, and strong capacity for proliferation and potential to differentiate toward a chondrogenic phenotype. Areas covered: A current overview of human, in vivo, and in vitro evidence on the use of MSCs in cartilage tissue engineering. Expert opinion: We demonstrate robust evidence that MSCs have the potential to regenerate articular cartilage. We also identify the complexity of designing a suitable preclinical model and the challenges in considering its clinical application such as type of MSC, scaffold, culture construct and the method by which growth factors are delivered. Of great interest is further characterization of the factors that may prevent MSC-derived chondrocytes to undergo premature hypertrophy and to understand what enables the terminal developmental pathway for permanent hyaline cartilage regeneration. Despite this, there is an abundance of evidence suggesting that MSCs are a desirable cell source and will have significant impact in tissue engineering of cartilage in the future.     

运动性关节软骨缺损支架材料的选择及其生物相容性

背景：骨软骨支架是用于承载细胞,供细胞黏附、生长、增殖、分化的载体。目的：总结运动性关节软骨缺损支架材料的应用进展及其生物替代材料的生物相容性。方法：以＂关节软骨,生物材料,工程软骨,支架材料,生物相容性＂为中文关键词,以＂tissue enginneering,articular cartilage,scaffold material＂为英文关键词,采用计算机检索维普数据库、PubMed数据库1993-01/2010-11相关文章。纳入与有关修复关节软骨损伤、生物材料、支架材料、生物相容性等相关的文章。以20篇文献为重点对运动性关节软骨缺损修复用的生物材料的生物相容性进行了讨论。结果与结论：天然软骨支架材料因其具有细胞识别信号,故生物相容性好,细胞黏附率高,但力学性能较差。有些人工合成材料生物相容性不理想、亲水性差、对细胞吸附不足,人工合成高分子聚合物生物相容性良好。复合支架利用不同生物材料的优点克制材料的局限性制备理想的复合支架,其混合比例、混合技术还有待进一步研究。目前尚无一种材料完全满足组织工程的要,通过材料制备技术的改进或将几种不同材料的复合,材料的性能会不断的提高。