以DNA测序及限制性酶切反应鉴定PCR产物特异性

目的：对PCR产物进行特异性鉴定。方法：采用DNA测序及限制性酶切反应方法。结果：DNA测序可排除PCR产物的假阳性。另一种简便易行的方法是，设计包含某一已知偏位性酶切位点的特异引物进行PCR，通过酶切反应及电泳分析鉴定其特异性。结论：此方法对PCR产物特异性鉴定十分必要。     

16s～23s rDNA间隔区序列RFLP分析在分枝杆菌分类鉴定中的应用

目的：通过对分枝杆菌１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡ ＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，评价其在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法：对２１种分枝杆菌和９种亲缘关系较远的非分枝杆菌和４种亲缘关系较近的非分枝杆菌的１６ｓ～２３ｓ ｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并对扩增产物进行限制性内切酶ＨａｅШ．Ｍｓｐ ｉ消化反应，分析不同菌种扩增 段及其限制性片段长度多态性的差异。结果：ＰＣＲ扩增结果显示：分枝     

副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆

目的探讨克隆副溶血性弧菌（Ｖｐ）耐热直接溶血毒素基因的方法。方法用ＰＣＲ技术扩增目的基因,双酶切载体 ｐＵＣ１９和目的基因 ＤＮＡ,连接并转化大肠杆菌 ＪＭ１０９。对重组质粒进行 ＰＣＲ鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电 泳显示,标准株Ｖｐｌ４－９０基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物长约６００ ｂｐ。阳性克隆的ＰＣＲ产物也为一长约６００ ｂｐ）的条带,经双 酶切可切出一约 ６００ ｂｐ的条带。 ＤＮＡ 测序结果表明与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中的序列有 ９９．６５％的同源性。结论利用该方法成功 克隆了目的基因,为制备用于现场检测的基因探针和Ｖｐ的保护性菌苗以及阐明Ｖｐ的致病机理奠定了基础。     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

腺病毒—单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化．经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶     

人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

PCR影响因素初探（一）Mg~（＋＋），dNTP等对PCR扩增结果的影响及控制方法

为进一步提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的特异性和敏感性，本文探索了ＰＣＲ反应体系中ＤＮＴＰ，Ｍｇ~，引物及Ｔａｑ酶等对ＤＮＡ扩增结果的影响及控制方法。结果表明上述因素对扩增结只有重要影响作用。通过实验确定上述成分的最佳浓度及采用ＤＮＡ杂支技术或序列测定技术检测ＰＣＲ产物，不仅将有助于进一步提高此反应的特异性和敏感性，而且亦将有助于扩大ＰＣＲ技术的应用范围。     

一种简单有效的平端PCR产物克隆方法

介绍一种使用ｐＵＣ质粒做为载体进行平端ＰＣＲ产物连接的方法。首先将特异的ＰＣＲ扩增产物纯化，不经任何处理，与用ＳｍａⅠ内切酶消化的载体ｐＵＣ质粒进行连接，并在连接体系中加入ＳｍａⅠ内切酶，２３℃连接１８～２０小时。转化宿主菌后，挑选白色菌落进行重组鉴定。在ＰＣＲ产物＜５００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化菌白色菌落的７０％，而＞１０００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化白色菌落的１０～２０％。     

腺病毒-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化。经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶切图谱,重组病毒具高滴度的感染活性。结论：ＡＤＶ－ＴＫ基因的构建为ＨＳＶ－ＴＫ基因的临床应用提供了更为有效的手段。     

遗传性因子Ⅶ缺乏症一家系基因分析

目的 鉴定遗传性凝血因子Ⅶ（ＦⅦ）缺乏症一家系的ＦⅦ基因突变。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）分段从基因组ＤＮＡ扩增出先证者及正常人的ＦⅦ基因各显子ＤＮＡ片段,经ＰＣＲ产物直接测序法,分析各片段序列;采用ＰＣＲ结合限制性内切酶ＨｇｉＣ Ⅰ酶切分析先证者及其家系成员的ＦⅦ基因组ＤＮＡ片段。结果 先证者的ＦⅦ基因第３２９密码子存在ＴＧＴ→ＧＧＴ错义突变;限制性内切酶酶切的结果确证先证者为Ｃ３２９Ｇ纯合型突变,家系中有３个成员为Ｃ３２９Ｇ杂合型突变。结论 在国内外首次发现存在于遗传性ＦⅦ缺乏性患者的ＦⅦ基因第３２９密码子ＴＧＴ→ＧＧＴ突变,导致所编码的半胱氨酸被甘氨酸替代;ＰＣＲ结合限制性内切酶ＨｇｉＣ Ⅰ酶切分析可用于该突变的快速诊断。     

丝誊具菌高分子量DNA的提取研究

为寻求一种简便高效的提取真菌基因组ＤＮＡ的方法，采用经改良的液氮研磨饱和酚抽提法及高盐沉淀法，从液体培养的鸡从菌菌丝本中提取了高分子量的基因组ＤＮＡ。用紫外吸收光谱、限制酶切、ＲＡＰＤ－ＰＣＲ反应及琼脂糖凝胶电脉等方法进行了鉴定。结果显示，两种方法匀可以获得分子量大、样品较纯的基因组ＤＮＡ，用限制酶均能有效地消化，并可有效地用于ＰＣＲ扩增。其中高盐沉淀法提取的ＤＮＡ产量高（每克菌丝体可获ＤＮＡ０．     

组织型纤溶酶原激活物cDNA克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活物（t－ＰＡ）cＤＮＡ并构建含t－ＰＡ基因的腺病毒表达 载休划硫氰酸胍；－酚－氢仿一步法从Ｂｏｗｅｓ黑色素瘤细胞中提取总ＲＮＡ，并经反转录ＰＣＲ获得t－ＰＡcＤＮＡ。将质粒pＵＣ１９双酶切并纯化回收大片段，与纯化后的ＰＣＲ产物连接构成pＵＣ１９t－ＰＡ，转化大肠肝菌ＪＭ１０９，挑选白色克隆作酶切鉴定、测序，pＵＣ１９t－ＰＡ及腺病毒载体pＡdＭＶ（６．６７ｋｂ）分别双酶切前者回收１     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的　构建ｐｃＤＮＡ3.1(+)胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法　将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应 (ＲＴ ＰＣＲ)产物克隆至ｐｃＤＮＡ3.1(+)真核表达载体上 ,经酶切鉴定及测序分析并以ＦｕＧｅｎｅ 6介导法转染真核细胞 ,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果　ＲＴ ＰＣＲ产物为 6 40ｂｐ特异片段 ,ｐｃＤＮＡ3.1(+)ＧＤ ＮＦ重组体经酶切后分别出现 6 40ｂｐ和 30 0ｂｐ片段 ,测序分析与文献报道结果完全一致 ,表明重组ｐｃＤＮＡ3 .1(+)ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功。可见…     

丝状真菌高分子量DNA的提取研究

为寻求一种简便高效的提取真菌基因组ＤＮＡ的方法，采用经改良的液氮研磨饱和酚抽提法及高盐沉淀法，从液体培养的鸡土从菌菌丝体中提取了高分子量的基因组ＤＮＡ。用紫外吸收光谱、限制酶切、ＲＡＰＤ—ＰＣＲ反应及琼脂糖凝胶电泳等方法进行了鉴定。结果显示，两种方法均可以获得分子量大、样品较纯的基因组ＤＮＡ，用限制酶均能有效地消化，并可有效地用于ＰＣＲ扩增。其中高盐沉淀法提取的ＤＮＡ产量高（每克菌丝体可获ＤＮＡ０．８３ｍｇ），方法简便，对人体无毒害，是较理想的提取真菌ＤＮＡ的方法     

构建TA载体快速克隆PCR产物

目的　为了快速克隆ＰＣＲ产物,本实验构建了简单、方便的 ＴＡ载体。方法 ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）经 ＥｃｏＲ Ｖ酶切形成平端切口,在ＴａｑＥ的催化下加一个ｄＴＭＰ形成３’端带有Ｔ的粘端载体,在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下,将ＰＣＲ产物互补连接于ＴＡ载体上,重组质粒转化细菌,碱裂解法提取重组质粒ＤＮＡ,酶切及电泳鉴定。结果ＴＡ载体成功地克隆了ＰＣＲ产物。结论构建的ＴＡ载体简单、方便,可以克隆任何ＰＣＲ产物。     

多聚酶链反应产物HindⅢ酶切方法探讨

多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是当代分子生物学的重要技术。在对ＰＣＲ产物进行限制酶消化时，由于限制酶需一定的反应条件，往往需对ＰＣＲ产物进行纯化。我们在应用ＨｉｎｄⅢ酶切ＰＣＲ产物时，采用了纯化后酶切及直接酶切两种方法。经比较，二法结果无差异。由于直接酶切法省去了纯化过程的繁琐步骤，提高了实验效率，故我们认为应用ＨｉｎｄⅢ酶切ＰＣＲ产物时可采用直接酶切法。１　材料和方法１．１　材料１．１．１　样本　正常人外周血取自健康献血员。１．１．２　引物　引物顺序为Ｃ…     

SIV模型猴石蜡包埋淋巴结组织DNA的提取及病毒基因检查

从取材于３只ＳＩＶ感染治疗猴和４只ＳＩＶ艾滋病模型猴治疗前后的１１份石蜡包埋淋巴结活检组织中提成基因组ＤＮＡ，分别用ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ方法检测ＳＩＶ病毒基因，ＰＣＲ共检出１０份阳性，巢式ＰＣＲ检测１１价样品均阳性，而同期采样的猴外周血标本病毒分离仅３份阳性，ＰＣＲ扩增产物的特异性用限制性内切酶酶切反应得到证实。实验说明，从淋巴结组织中检测ＳＩＶ的病毒基因较外周血病毒分离更能真实地反映病毒感染状况，本研究将对全面和正确评价艾滋病药吻和疫苗治疗效果提供帮助。     

三种方法对日本血吸早抗原cDNA克隆的筛选和鉴定

利用融源表达、平板裂解法和ＰＣＲ扩增三种不同方法分别对日本血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因进行鉴定和分析，８个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达，表达蛋白分子量为１４０－１５０ｋＤａ，抗原ｃＤＮＡ基因经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ酶解后，琼脂糖凝胶电泳显示其大小为７００－９００ｂｐ，ＰＣＲ能扩增出特异性条带，结果表明，上述三种方法能从蛋白质和核酸水平有铲地鉴定血吸虫抗原ｃＤＮＡ基因。     

NADH—细胞色素b5还原酶基因Arg57Gln／Cys203Tyr复合杂合？…

调查中国人遗传性高铁血红蛋白血病患ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶基因突变情况。方法采用逆转录－聚合酶链反应产物直接测序法,分析ＲＣＭ患ｂ５Ｒ基因的ｃＤＮＡ全部编码序列;ＰＣＲ结合限制内切酶ＭｓｐⅠ和ＲｓａⅠ酶切分析患及其母亲的ｂ５Ｒ基因组ＤＮＡ扩增片段。