辐射诱导小鼠免疫细胞蛋白质表达变化及酪氨酸磷酸化

目的：为进一步了解低剂量辐射对免疫细胞早期蛋白质表达及酪氨酸磷酸化的影响。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、光密度扫描及免疫沉淀方法观察75mGyX射线全身照射对小鼠免疫细胞蛋白质表达变化及酪氨酸磷酸化的影响。结果：照射后小鼠胸腺细胞Mr=28000及Mr=43000蛋白质表达增强；脾细胞Mr=32000及Mr=43000蛋白质表达增强；三种蛋白质均发生酪氨酸磷酸化。结论：这些早期变化的蛋白质参与复杂的细胞功能调节，可能与辐射兴奋效应有关。     

两种酪氨酸激酶抑制剂对结肠癌细胞增殖的影响

目的:研究两种酪氨酸激酶抑制剂对体外培养的HT-29结肠癌细胞生长的影响及可能机制.方法:用MTT比色法观察不同浓度的Genistein及Tyrphostin AG1478对体外培养的结肠癌细胞生长的影响;免疫细胞化学法检测两种酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)对肿瘤细胞PCNA表达的影响;Western blot技术分析Genistein及Tyrphostin AG1478对结肠癌细胞ERK-1及pERK表达的影响.结果:不同浓度的Genistein及Tyrphostin AG1478对HT-29结肠癌细胞的增殖均具有抑制作用,并具有良好的量-效关系.免疫细胞化学检测表明,Genistein及Tyrphostin AG1478明显下调HT-29细胞PCNA表达.蛋白质印迹检测发现,两种酪氨酸激酶抑制剂不抑制ERK表达,但能够抑制ERK磷酸化.结论:酪氨酸激酶抑制剂Genistein及Tyrphostin AG1478能有效抑制HT-29结肠癌细胞生长,其作用机制与抑制肿瘤细胞ERK表达及磷酸化有关.     

游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体与胰岛素受体底物1的表达和酪氨酸磷酸化的影响

目的：探讨游离脂肪酸是否通过改变胰岛素信号传导蛋白的表达和功能状态影响骨骼肌细胞的葡萄糖代谢。方法：分离培养Ｗｉｓｔａｒ大鼠骨骼肌细胞。软脂酸（０．２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）或油酸（０．１２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）与骨骼肌细胞共同孵育６、１２、２４ｈ，提取蛋白后用Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交方法检测胰岛素受体和胰岛素受体底物１（ＩＲＳ１）的蛋白水平，同时应用免疫沉淀和免疫杂交技术检测胰岛素刺激后胰岛素受体β亚单位和ＩＲＳ１的酪氨酸磷酸化程度。结果：（１）软脂酸或油酸作用后骨骼肌细胞的胰岛素受体蛋白质表达量无改变。（２）骨骼肌细胞与软脂酸或油酸共同孵育１２和２４ｈ后胰岛素受体β亚单位的酪氨酸磷酸化显著降低。（３）骨骼肌细胞在软脂酸或油酸作用后各个时间点的ＩＲＳ１蛋白质量均明显降低。（４）骨骼肌细胞经软脂酸或油酸作用后ＩＲＳ１的酪氨酸磷酸化在各个时间点均显著降低。结论：游离脂肪酸可能通过抑制骨骼肌细胞的ＩＲＳ１蛋白质表达和胰岛素受体的酪氨酸磷酸化以及ＩＲＳ１的酪氨酸磷酸化阻滞胰岛素信号传导，引起骨骼肌胰岛素抵抗     

蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较

为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法，采用免疫沉淀法及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明，照射后１７５００、２２０００、２８０００、３２０００、４００００、４３０００及５３０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，照射后２８０００、３２０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中，免疫沉淀法优于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。     

抗磷酸酪氨酸抗体的制备、纯化和应用

目的 制备抗磷酪氨酸多克隆抗体,利用引抗体研究缺血再灌注对海马磷酸酪氨酸蛋白（ｐ－ｔｙｒ－ｐｒ）免疫反应性的影响。方法 以偶联磷酸化酪氨酸的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为免疫原免疫兔获得抗血清。将磷酸酪氨酸偶联到溴化氰活化的ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上。抗血清经到酪氨酸－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,所得抗体专一性强,并经ｄｏｔ ｂｌｏｔ鉴定。结果 抗体仅对酪氨酸磷酸化的蛋白质包括酪氨酸磷酸化的血清白     

香烟烟雾提取物对猪气道上皮细胞β-连环素及酪氨酸磷酸化的影响

目的 观察香烟烟雾提取物（CSE）和酪氨酸激酶抑制剂（tyrophostin 25)对气道上皮细胞（AEC）酪氨酸磷酸化程度、细胞Src蛋白（c-Src)及β-连环素（β- cat)表达的影响,探讨细胞酪氨酸磷酸化程度及β- cat在吸烟致AEC损伤和修复中的作用及调控机制。方法 体外培养猪AEC,将培养细胞分成3组;N组：加无血清培养基;C组：在无血清培养基上分别加CSE;CT组：加tyrophostin 25及CSE。每组随机检测300个AEC中β- cat免疫细胞化学染色的分布规律;利用图像分析技术,每组随机检测30个AEC的酪氨酸磷酸化程度、c-Src,β- cat mRNA的变化。结果 C组加入20％的CSE作用4h和24h后,AEC蛋白质酪氨酸磷酸化程度分别是N组的1.51倍和3.44倍（P＜0．0001）,胞膜上β- cat阳性表达率分别为26.7%和38．7％,较N组（分别为83.3%和81．3％）明显下降（P＜0．0010）。与N组比较C组胞质中c-Src的浓度分别降低了47．9％和51．4％（P＜0．0001）;CT组酪氨酸磷酸化程度及胞膜上β- cat表达的变化接近N组。而C组和CT组β- cat mRNA含量均较N组有下降（P＜0．0001）。结论 上皮细胞的蛋白质酪氨酸磷酸化程度的变化可能介导了香烟对气道上皮细胞的损伤,而β- cat蛋白质可逆性磷酸化对粘附连接的结构和功能的维持发挥重要作用。     

胃泌素干预影响人结肠癌细胞P190RhoGAP磷酸化的机制

目的:研究胃泌素对人结肠癌细胞P190RhoGAP的酪氨酸磷酸化水平的影响。方法:使用胆囊收缩素2受体(CCK2R)的真核表达载体pCR3.1/CCK2R转染人结肠癌细胞株Colo320,上调胃泌素表达;使用胃泌素拮抗剂下调胃泌素表达。使用相同浓度的胃泌素(1×10-7mol/L)按时间梯度刺激细胞;采用蛋白质印迹法检测总FAK、酪氨酸磷酸化的FAK的表达情况,并确定FAK最大磷酸化时间点;以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测FAK最大磷酸化时间点的P190RhoGAP的酪氨酸磷酸化水平。结果:胃泌素引起FAK最大酪氨酸磷酸化作用时间点为12 h,胃泌素刺激12 h较0 h、胃泌素拮抗剂+胃泌素刺激12 h后P190RhoGAP的酪氨酸磷酸化水平明显增加。结论:P190RhoGAP为FAK的下游信号分子,酪氨酸磷酸化的P190RhoGAP在胃泌素-CCK2R-FAK信号通路引起肿瘤细胞的侵袭、浸润、转移过程中发挥重要作用。     

蛋白酪氨酸激酶活性变化在大鼠胃粘膜损伤修复中的作用及机理

目的 探讨大鼠胃粘膜损伤后蛋白酪氨酸激酶（ＰＴＫ）活性的变化及通过影响细胞核蛋白质磷酸化和转录因子激活蛋白（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ＡＰ－１）的活性对胃粘膜修复的作用及意义。方法 以２０ｍｍｏｌ／Ｌ去氧胆酸钠（ＤＯＣ）给ＳＤ大鼠灌胃，损伤胃粘膜，损伤后３小时取胃，抽提分离细胞膜和细胞核组分，以膜结合法检测细胞膜ＰＴＫ活性和细胞核蛋白质的磷酸化，以凝胶电泳漂移实验检测ＡＰ－１活性，     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B与胰岛素抵抗及2型糖尿病的关系

蛋白质酪氨酸磷酸化是细胞代谢、信号传导及细胞周期调控的重要调节步骤。蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B（Protein—tyrosine Phosphatase-1B,PTP1B）属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族,是在体内广泛表达的胞内蛋白质酪氨酸磷酸酶,由PTPN1基因编码,PTP1B通过对胰岛素受体激酶（insulin receptor kinase,IRK）或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用对胰岛素信号传导进行负调节：PTP1B表达的改变,与人类的多种疾病相关,包括2型糖尿病和癌症等：越来越多的证据表明：PTP1B在调节胰岛素敏感性和能量代谢过程中均起着重要作用。     

SOCS3基因对肺腺癌细胞株A549中c-Myc表达的影响

目的探讨SOCS3基因对人肺腺癌细胞株A549中c-Myc表达的调控作用。方法以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至人肺腺癌细胞株A549,RT-PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3mRNA和蛋白表达;Westernblot检测STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平变化;sqRT-PCR测定转染前后细胞中c-MycmRNA的表达。MTT法检测转染前后细胞增殖变化。结果RT-PCR和免疫细胞化学证实转染后细胞中SOCS3稳定表达;Westernblot证实pEFSOCS3转染组细胞STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平明显降低(P <0.01);sqRT-PCR显示pEFSOCS3转染组细胞中c-MycmRNA的表达显著降低。MTT法结果示pEFSOCS3转染组细胞增殖明显受到抑制。结论SOCS3蛋白可能通过抑制A549细胞中STAT3蛋白的酪氨酸磷酸化从而下调c-Myc基因的表达,最终抑制A549增殖。     

人胎肝细胞生长刺激物质与酪氨酸蛋白激酶的关系

利用从人胎肝提取的肝细胞生长刺激物质（ｈＨｓｓ），以小鼠肝细胞质膜蛋白作为受体及内源性底物，以Ｐｏｌｙ（ＧｌｕＮａ，Ｔｙｒ）４：１作为外源性底物，通过磷酸化实验，对ｈＨＳＳ的作用及其与酪氨酸蛋白激酶活性之间的关系进行了研究。利用抗酪氨酸磷酸酯抗体免疫沉淀法，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显形及液体闪烁计数等方法进行测定。结果证明：ｈＨＳＳ可刺激并增强肝细胞膜受体的酪氨酸蛋白激酶的活性，后者可使膜蛋白某些组分及外源性底物磷酸化增强；ｈＨＳＳ的作用与酪氨酸蛋白激酶的活性密切相关。     

HER2/neu抗体对SKBR3乳腺癌细胞株酪氨酸磷酸化及细胞增殖的影响(摘要)

研究抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ胞外区的特异性抗体对ＳＫＢＲ３乳腺癌细胞株酪氨酸磷酸化及细胞增殖的影响。方法Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法及抗体介导的特异性细胞增殖试验;筛选乳腺癌病人抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体阳性血清ＩｇＧ的ＥＬＩＳＡ方法。结果试验发现单抗ｃｎｅｕ５对ＳＫＢＲ３细胞ｐ１８５酪氨酸磷酸化有明显促进作用,但对细胞增殖的影响不明显;而单抗ｃｎｅｕ２对ＳＫＢＲ３细胞ｐ１８５酪氨酸磷酸化及细胞增殖均有明显作用。在此基础上,收集乳腺癌病人血清１４份,分离纯化其血清ＩｇＧ,并经ＥＬＩＳＡ方法筛选出５份乳腺癌病人抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体阳性血清ＩｇＧ。细胞增殖试验发现该５份标本中有３份对ＳＫＢＲ３细胞增殖有显抑制作用。选其中１份抑制增殖的阳性血清ＩｇＧ进一步研究其对ＳＫＢＲ３细胞ｐ１８５酪氨酸磷酸化的影响,结果发现该病人血清ＩｇＧ对细胞酪氨酸磷酸化也有抑制作用。结论抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ的特导性抗体可能通过抑制细胞的信号传递系统而抑制肿瘤生长。     

Src酪氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子诱导的肺腺癌细胞生长的作用及机制

目的 探讨Src酪氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子（EGF）诱导的肺腺癌细胞生长浸润的作用及其机制。方法 选用PC-9和A549细胞进行培养,分别给予不同浓度的Src酪氨酸激酶抑制剂和EGF,利用MTT比色法和Boyden-chamber法检测PC-9和A549细胞增殖及浸润情况,台盼蓝染色检测细胞活力,蛋白质印迹检验Src蛋白的表达和磷酸化及其下游信号磷酸化情况。结果 抑制Src酪氨酸激酶可以在不影响细胞活力的情况下抑制PC-9和A549细胞的增殖浸润,EGF可以增强EGF受体（EGFR）、Src、促丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及AKT的磷酸化,Src酪氨酸激酶抑制剂可以抑制这种磷酸化。结论 抑制Src酪氨酸激酶可以通过调节EGFR及其下游信号通路抑制肺腺癌细胞的增殖浸润。     

颈动脉中两个主要酪氨酸磷酸化蛋白质,FAK和Paxillin在球囊损伤后减少

目的 确定正常动脉中主要的酪氨酸磷酸化蛋白质以及它们在球囊损伤后的变化。方法和结果 用矾酸钠溶液灌注Sprague-Dawley鼠的同时，分别切除正常的及球囊损伤后的颈动脉，主动脉和其它组织；使之云浆化，将澄清的组织溶解产物用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀反应，然后用FAK，Paxillin和磷酸酪氨酸的抗体进行Western印迹分析，结果显PP125和PP68是两个主要存在于正常颈动脉的酪氨酸磷酸化蛋白质，用FAK和Paxillin的抗体再探查后确定了这些蛋白质是FAK和Paxillin；用磷酸酪氨酸抗体免疫去除法可消除FAK和Paxillin，表明这些蛋白质大多数在动脉中被酪氨酸磷酸化；动脉中比其它被检查的组织，如下腔静脉和心脏包含更多酪氨酸磷酸化的FAK。随后进行的颈动脉球囊损伤后检测显示FAK和Paxillin的含量减少。结论 我们的发现表明FAK和Paxillin在保持动脉的正常结构和功能上发挥了重要作用，并且能对球囊损伤做出反应。     

SHP-1蛋白在γ射线诱发的白血病小鼠胸腺细胞中的变化

目的:探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1蛋白在γ射线体外诱发的白血病小鼠胸腺细胞中的变化特点.方法:建立γ射线体外诱发BALB/c小鼠白血病模型.实验分为癌变组、未癌变组及对照组,从各组小鼠获取胸腺细胞,应用Western印迹、免疫沉淀法及生物化学方法检测各组胸腺细胞SHP-1蛋白质的表达、酪氨酸磷酸化水平及酶活性.结果:癌变组SHP-1蛋白的表达明显高于对照组及未癌变组(P＜0.01),但各组SHP-1的酪氨酸磷酸化水平及酶催化活性差异不显著(P＞0.05),且其酪氨酸磷酸化水平与酶活性间存在明显相关性.结论:在γ射线诱发的白血病小鼠的胸腺细胞中,SHP-1蛋白表达明显升高,但可能存在酪氨酸磷酸化障碍,导致其活性降低,即表现出SHP-1蛋白表达与其活性分离现象,提示辐射致癌中SHP-1蛋白可能存在功能障碍.     

去甲肾上腺素及血管紧张素Ⅱ对大鼠心肌细胞胰岛素受体及胰岛素受体底物1酪氨酸磷酸化的综合效应

目的:初步探讨去甲肾上腺素（NE）与血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对大鼠心肌细胞胰岛素受体β亚基（Ins-Rβ）及胰岛素受体底物1（IRS-1）酪氨酸磷酸化的综合效应,以及心肌胰岛素抵抗的机制。方法:培养新生大鼠心肌细胞。按照浓度梯度,将相同浓度的NE与AngⅡ的混合液加入培养基中,培养72 h后,采用Western blotting法检测胰岛素信号分子蛋白表达水平。另于每个实验组中加入AngⅡ受体阻断剂氯沙坦,分别观察NE与AngⅡ的独立效应。结果:相同浓度的NE与AngⅡ混合液可引起心肌细胞Ins-R、IRS-1及葡萄糖转运体4（GLUT4）等蛋白表达减少,Ins-Rβ亚基酪氨酸磷酸化等蛋白表达减少,IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白表达增加（P<0.05）。1 μmol/L氯沙坦对Ins-Rβ亚基酪氨酸磷酸化蛋白表达无显著影响（P>0.05）,可减少IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白表达（P<0.05）。结论:相同浓度的NE与AngⅡ的共同作用可降低大鼠心肌细胞Ins-Rβ酪氨酸磷酸化水平,升高IRS-1酪氨酸磷酸化水平。NE为引起Ins-Rβ酪氨酸磷酸化水平降低的主要原因,AngⅡ升高为IRS-1酪氨酸磷酸化水平升高的主要原因。     

GDM孕妇网膜脂肪组织中Chemerin的表达与IRS-1及其酪氨酸磷酸化分析

目的通过检测网膜脂肪组织中Chemerin的表达与胰岛素受体底物-1表达及酪氨酸磷酸化水平,探讨Chemerin与GDM胰岛素抵抗的关系。方法将研究对象分为GDM组及正常对照组NGT各22名,剖宫产术中收集网膜脂肪组织2g,Western blot及qPCR方法检测胎盘组织中Chemerin、IRS-1的表达及免疫沉淀法检测IRS-1的酪氨酸磷酸化水平。结果 GDM组网膜脂肪组织中Chemerin蛋白质表达显著增加[2.99 (0.04,7.90)vs 2.21(0.02,13.30),P=0.010];GDM组IRS-1[3.52(2.51,4.49)vs 5.47(4.04,8.98),P=0.024]蛋白表达明显降低;GDM组IRS-1酪氨酸磷酸化[0.60(0.01,1.74) vs 4.06(0.06,54.41),P=0.012]显著降低;相关性分析发现Chemerin蛋白表达与OGTT2h血糖密切相关;Chemerin mRNA与产前BMI密切相关;Chemerin蛋白表达与IRS-1蛋白正相关;IRS-1酪氨酸磷酸化水平与OGTT 0 h PG、OGTT 2 h PG密...     

RG50864对PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响

目的 :研究酪氨酸蛋白激酶抑制剂 RG5 0 86 4对 PDGF诱导的肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)酪氨酸磷酸化蛋白表达的影响。方法 :用原代培养的小牛肺动脉平滑肌细胞 ,采用 Western Blot方法分析 RG5 0 86 4对 PDGF诱导的PASMC酪氨酸磷酸化蛋白的定性表达。结果 :RG5 0 86 4 (0 .1 μmol/ L)能显著抑制 PDGF诱导的 PASMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达 ,尤以 85～ 1 80 KDa明显 ,当 RG5 0 86 4浓度达 1 0 0 μmol/ L 时 ,则能完全抑制磷酸化蛋白的产生 ,其作用呈明显的剂量效应关系。结论 :RG5 0 86 4能显著地抑制 PDGF诱导的 PASMC酪氨酸磷酸化蛋白的表达     

蛋白酪氨酸磷酸酶-1B与2型糖尿病相关性的研究现状

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP)是蛋白质的酪氨酸磷酸化的重要参与因子。而蛋白质的酪氨酸磷酸化是翻译后修饰的主要方式之一,此反应受作用相反的一对酶调节,即蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)使酪氨酸磷酸化和蛋白酪氨酸磷酸酶使其脱磷酸。     

γ线诱发的白血病小鼠胸腺细胞中SHP-2表达及功能的研究

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2的表达及其功能在γ射线体外诱发的白血病小鼠胸腺细胞中的变化情况,为进一步从细胞信号转导途径入手研究辐射致癌的分子机制奠定基础.方法BALB/c小鼠336只分为癌变组、未癌变组及对照组,应用Western blot、免疫沉淀法及生物化学方法检测各组SHP-2蛋白质的表达、酪氨酸磷酸化水平及酶活性.结果癌变组SHP-2蛋白的表达、酪氨酸磷酸化水平及酶催化活性间存在明显相关性,均明显高于对照组及未癌变组(P＜0.01).结论在γ射线诱发的白血病小鼠胸腺细胞中,SHP-2蛋白的表达及其功能均明显增强,可能与γ射线诱发小鼠白血病的发生密切相关.