小鼠睾丸体外培养模型研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对睾酮合成及机制的影响

【摘要】 目的构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定。方法采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中。经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性。结果成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性。结论采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源。     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

【目的】山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。【方法】利用PCR点突变方法改造山蛭素基因 ,将山蛭素基因克隆到pGEM Teasy载体中。对重组质粒测序 ,构建了毕赤酵母表达载体 pPIZB Hs ,然后转化有活性的GS115酵母菌株 ,筛选表达酵母菌株GS115 ,摇瓶发酵。【结果】改造的山蛭素基因在重组酵母中表达 ,重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。【结论】利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因 ,并能在毕赤酵母中表达     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

大鼠DAF蛋白真核表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建大鼠促衰变因子(DAF)的酵母真核表达载体,诱导其表达并对生物学特性进行鉴定.方法 采用RT-PCR技术从大鼠肝脏组织中扩增出DAF基因并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K质粒中.经酶切鉴定后,将pPIC9K-DAF转化至毕赤酵母菌GS115,通过G418-YPD平板筛选高拷贝转化子.转化子经甲醇诱导表达后,对表达的DAF蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定并检测重组蛋白的生物活性.结果 成功克隆大鼠DAF基因,并筛选出pPIC9K载体中的DAF阳性克隆,证实所获得相对分子质量约为70×103大小的重组蛋白具有大鼠DAF蛋白的抗原性和生物学活性.结论 采用分子克隆的方法成功构建大鼠DAF蛋白的毕赤酵母真核表达载体,能为补体及免疫研究提供高效的大鼠DAF蛋白来源.     

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的：在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果：序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论：重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。     

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的 探讨在毕赤酵母中进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPl588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上，使其准确融合于α交配因子分泌信号之后，电击转化毕赤酵母宿主菌GS115／His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR．分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后，分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coli JM109的抑菌实验。结果BP1588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中，并有转录产物mRNA的存在，表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。     

恶性疟原虫3D7株主要裂殖子表面抗原C—末端基因的全合成及其表达

目的：在毕赤酵母表达系统中获得大量构象正确的3D7／MSP1－42重组蛋白进行疫苗有效性试验。方法：采用不对称PCR法拼接合成了3D7／mps1-42基因（1202bp),用电穿孔法将合成基因导入毕赤酵母并进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物。结果：按毕赤酵母密码子使用频率重新设计并全合成了3D7/msp1-42基因序列,该合成基因在毕赤酵母系统（Pichia pastoris)中得到高水平分泌表达,产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论：重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达,并产生构象正确的重组蛋白,从而解决了该天然基因在毕赤酵母中不表达的问题。     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPV VP2基因进行扩增,将CPV VP2基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPV VP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPV VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64.35 kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPV VP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

人血管内皮生长因子受体2胞外段在毕赤氏巴斯德酵母中的表达

目的探讨在毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）中高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段（heVEGFR-2）的可行性。方法从重组质粒pORF-heVEGFR-2经PCR获全长heVEGFR-2 DNA,构建重组毕赤氏巴斯德酵母分泌性表达载体,电转化Pichia pastoris X-33。用抗药性表型和甲醇诱导筛选出重组heVEGFR-2蛋白表达阳性的转化子（X-33-heVEGFR-2）。结果SDS-PAGE显示,获分子量约108kDa的重组heVEGFR-2蛋白,约占X-33-heVEGFR-2分泌性表达蛋白总量的45％。该重组蛋白在表达上清中的质量浓度达80mg／L。其heVEGFR-2部分分子量约106kDa。Western blot证实,该蛋白能特异地与大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体结合。结论毕赤氏巴斯德酵母能高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段蛋白全段。     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia Pastoris酵母中的表达

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定.方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肰的β-NGF基因序列;用A-r克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入CS115中,甲醇诱导分泌蛋白.结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SIS-PAGE电泳在14.OKD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性.结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性.     

Annexin32的酵母表达及免疫原性分析

目的：在毕赤酵母中表达Annexin32并研究其功能。方法：用G418法快速筛选出的9个高拷贝转化子，经平板培养法（MD和MM）及PCR鉴定表型后，分别在BMMY、BMM、MM3种培养基中以甲醇诱导表达，培养上清行SDS－PAGE和Western印迹鉴定，用（NH4）2SO4＋PI法沉淀，过FPLC－Superdex75分子筛纯化蛋白并以此免疫小鼠。结果：有两个表型为Mut^a的高拷贝转化菌表达量较高，以BMMY为优，表达产物有两条带，相对分子质量分别约为3.8万和4万，占分泌总蛋白的80％以上，产物浓度为200－350mg/L。Western印迹证实两条表达产物均具有天然Annexin32分子的免疫原性。动物实验证明，酵母表达的Annexin32的免疫原性明显高于原核表达者。结论：在毕赤酵母中成功表达了Annexin32，为进一步研究打下了基础。     

人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法：从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果：经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank（登录号NM002006）报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18 000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论：成功克隆了hbFGF 基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。     

乙型脑炎病毒E蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的：构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统。方泼：应用RT-PCR法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因,定向克隆入载体pPICZαA,将重组质粒以PineⅠ线性化并电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定。结果：PCR扩增产物约为1350bp,定向克隆获得pPICZαA-E表达载体,经测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性为100％,电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株GS115-E,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论：成功构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统,为进一步进行E蛋白真核表达研究奠定基础。