脐血造血干／祖细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应。方法 采用Mini-MACS分离纯化出CD34^ 细胞,在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况。结果 培养4周后,FL＋TPO＋SCF＋IL－6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加（P＜0．05）,并且能维持一定比例的CD34^ 、Thy-1^ 细胞;SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34^ 细胞基本检测不到。结论 与经典因子组合SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO相比,因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6能在较长时间内有效扩增脐血造血干／祖细胞,是一个优化组合方案。     

中晚孕期与足月胎儿脐血干/祖细胞功能特性研究

目的　对比研究中、晚孕期和足月胎儿脐血造血干 /祖细胞的表型及功能特性 ,为造血干细胞宫内移植和基因治疗先天性疾病提供新的思路。方法　采用免疫磁珠分离法、流式细胞术、液体培养、半固体甲基纤维素培养等对中、晚妊期及足月胎儿脐血造血干 /祖细胞比例、对细胞因子的反应性、体外增殖及自我更新能力进行了测定。结果　未足月脐血中CD34+ 、CD34+ CD38- 细胞及CD34+ 细胞中CD34+ HLL DR+ 、CD34+ CD38- 细胞比例较足月脐血高 (平均 3 1 4 %、0 76 %比 0 78%、0 1 8%及 9 8%、2 0 4%比 3 9%、1 4 6 % ) ,产生的集落形成单位量 (CFU)较足月脐血高 ,且与CD34+ 细胞比例成正相关 (r =0 83) ,长期培养启动细胞 (LTC IC)约是足月脐血的 3倍 (5 7± 1 2 / 1 0 5细胞比1 7± 0 8/ 1 0 5细胞 ,P <0 0 5)。在短期液体培养体系中 ,不同胎龄脐血干 /祖细胞具有相似的扩增潜能 ,体外细胞因子支持下培养 7天 ,CFU C、细胞总数、CD34+ 细胞数、CD34+ CD38- 细胞数达高峰 ,之后逐渐下降 ,其中以SCF +FL +TPO +IL 3 +IL 6组合条件下效果最显著。结论　未足月胎儿 (尤其是中妊期 )脐血与足月胎儿脐血相比 ,含有较高的造血干 /祖细胞 ,有较强的集落形成能力 ,对细胞生长因子刺激敏感 ,在体外能有效地扩增和     

脐血巨核祖细胞的体外扩增

目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34 细胞定向扩增巨核祖细胞.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34 细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34 、CD41a 、CD61 、CD34 CD41a 和CD41a CD61 )的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能.结果单用TPO 7 d时,CD34 CD41a 细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO IL-11 肝素组扩增倍数为TPO组、TPO IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P＜0.05).TPO IL-11 肝素组巨核祖细胞中大集落(＞50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO IL-11组均有明显增加(P＜0.05).将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率.电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板,有正常巨核细胞功能.结论TPO、IL-11和肝素组合的培养体系可有效扩增脐血巨核祖细胞.     

脐血造血干/祖细胞体外扩增的实验研究

目的探讨因子组合FL+TPO+SCF+IL-6对脐血CD34 +细胞的体外扩增效应.方法采用Mini-MACS分离纯化出CD34+细胞, 在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况.结果培养4周后,FL+TPO+SCF+IL-6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加(P＜0.05),并且能维持一定比例的CD34+、Th y-1+细胞;SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34+细胞基本检测不到.结论与经典因子组合SCF+IL-3+IL-6+G M-CSF+EPO相比,因子组合FL+TPO +SCF+IL-6能在较长时间内有效扩增脐血造血干/祖细胞, 是一个优化组合方案.     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

多种细胞因子组合对脐血干/祖细胞体外扩增的影响

目的　探讨在体外培养液中不同细胞因子组合对脐血 CD34+ 细胞的扩增作用以及扩增后的 CD34+ 细胞的造血功能。方法　用 FL、SCF、TPO、IL - 3、TL - 6组合成不同的实验组 ,对脐血中分离纯化的 CD34+ 细胞经 6d的短期体外扩增 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,L TC- IC、祖细胞集落群计数 ,从而求得较好的细胞因子组合组。结果CD34+ 细胞扩增倍数为 3 .1～ 8.6倍 ,16份脐血 CD34+ 细胞数达到 10× 10 6 以上的细胞总数 ;扩增的 CD34+ 细胞再造血功能与原始 CD34+ 细胞无显著差异。FL是扩增组合中不可缺少的细胞因子 ,同时还证实 TPO与其他细胞因子组合有扩增 CD34+ 细胞的作用 ,但单独使用 TPO稍长时间会使 CD34+ 细胞过多向巨核细胞分化。结论　 FST3 6细胞因子组合能使部份单位体积的脐血 CD34+细胞体外扩增达一定数量 ,为干细胞移植于成人提供了一定的实验依据与方法     

不同细胞生长因子组合对内皮祖细胞培养过程的影响

目的 观察不同细胞生长因子组合对体外培养过程中内皮祖细胞（EPC）数量和功能的影响。方法采用密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞，接种至包被有人纤维连接蛋白的培养皿，按照处理方式不同分为4组：对照组（不添加细胞因子）、VEGF组[加入血管内皮生长因子（VEGF）】、VEGF＋ECGS组[加入VEGF及内皮细胞生长添加剂（ECGS）]、多因子组（加入多种细胞生长因子），6d后倒置显微镜下观察各组细胞集落形成情况，测定黏附能力及收获的EPC数量。结果VEGF组及ECGS＋VEGF组细胞集落形成能力（11.53±1.72、1310±2．09）均显著强于对照组（587±0．55）（均P〈0.01】；ECGS＋VEGF组细胞黏附能力（55．53±18.32）显著强于VEGF组（24.92±4．31）（均P〈0．01）；多因子组细胞集落形成及粘附能力（33．83±5．10、65.22±10、98）均明显强于其余各组（P〈0．05或0．01）。VEGF组及VEGF＋ECGS组收获的EPC数量分别为对照组的185、284倍，均显著增加（均P〈0.01）；多因子组EPC数量虽多于VEGF＋ECGS组，但差异并无统计学意义（P〉0．05）。结论EPC体外培养时，添加VEGF及ECGS是一种经济有效的方法，可显著改善EPC的集落形成及黏附能力，增加EPC的收获数量。     

重组人FLT3配基对人脐血CD34＋细胞的体外扩增作用

目的观察重组人ＦＬ（ｒｈＦＬ）对脐血ＣＤ＋３４细胞的体外扩增作用。方法用磁性细胞分离仪富集人脐血ＣＤ＋３４细胞。在ＣＤ＋３４细胞体外液体培养中加入不同的细胞因子,在不同时间取样测试ＣＤ＋３４细胞阳性百分率、晚期造血祖细胞（粒细胞巨噬细胞集落生成单位及红系爆增式集落形成单位）并计数细胞总数。结果用磁性细胞分离仪可快速富集脐血ＣＤ＋３４细胞,纯度高达８０％以上。ｒｈＦＬ可协同白细胞介素（ＩＬ）－３、ＩＬ－６、粒－巨噬细胞集落刺激因子及促红细胞生成素促进ＣＤ＋３４细胞总数在７天时扩增３．４倍,无ｒｈＦＬ的对照组ＣＤ＋３４细胞只扩增１．５倍,但对晚期造血祖细胞的扩增无明显协同作用。结论用排除法证实ｒｈＦＬ主要扩增了早期造血祖细胞。     

体外诱导脐血造血细胞定向分化的研究

目的　探讨造血生长因子体外诱导脐血造血细胞向粒系细胞分化的能力。方法　从新鲜的脐血标本中分离的单个核细胞接种于含脐血血清和造血生长因子的IMDM培养液中悬浮培养 5周 ,采用有核细胞计数、免疫荧光染色计数和祖细胞集落测定对有核细胞总数、CD3 4+ 细胞和粒单系祖细胞进行动态检测。结果　用粒系集落刺激因子、粒单系集落刺激因子、干细胞因子、白介素 3和白介素 6培养脐血单个核细胞 3周 ,可以显著扩增有核细胞总数和CFU GM ,扩增倍数分别为培养前的 5 8 3倍和 12 2倍 ,且培养后的细胞以中性粒细胞为主。而CD3 4+ 细胞占细胞总数的比例则从 0 97%下降到 0 0 5 %。按照此培养条件 ,可以使单份新鲜脐血样本中有核细胞总数增加 ( 5 1± 2 3 )倍 ,CFU GM增加 ( 2 2± 0 95 )倍。结论　本培养体系在体外可以诱导脐血造血细胞向粒系定向诱导分化 ,从而增加单份脐血中粒单系祖细胞和粒细胞数量     

层流流体剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

目的本实验系在考察层流剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响作用。方法从脐血中分离出CD34＋细胞,接种入实验室自制的层流剪切力实验装置中,在不同大小的层流流体剪切力（0.5,1,2,4dyn/cm2）加载下进行体外扩增培养。结果较小的层流剪切力（0.5,1dyn/cm2）可促进造血干/祖细胞扩增,有利于早期造血干/祖细胞的维持,并能促进更多的细胞由G0/G1期进入S期 较大的层流剪切力（2,4dyn/cm2）抑制了造血干/祖细胞的扩增,导致其迅速分化 并使S期细胞的比例减小。结论在生物反应器体外扩增培养脐血CD34＋细胞时,其层流流体剪切力应控制在1dyn/cm2范围内。     

转hLIF基因逆转录病毒载体饲养层细胞的建立及其对脐血CD34＋造血干/祖细胞的扩增作用

目的建立转人白血病抑制因子（hLIF）基因逆转录病毒载体的饲养层细胞,并观察其对CD34＋造血干/祖细胞（HSPC）的扩增作用。方法建立转hLIF基因逆转录病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34＋HSPC,流式细胞术检测其纯度;将CD34＋HSPC与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果。结果建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实均有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34＋HSPC纯度可达（95.6±2.58）%,与饲养层细胞共培养后CD34＋HSPC可扩增8.74倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高。结论建立的转hLIF基因饲养层细胞对CD34＋HSPC有一定的扩增作用,且延缓其分化。     

慢性阻塞性肺病患者外周血中0D34^＋细胞数量变化

目的：观察中、重度慢性阻塞性肺病（COPD）患者外周血中CD34^＋细胞数量变化。方法：按入选标准收集25例中、重度COPD患者外周血,应用密度梯度离心法分离单个核细胞,采用CD34^＋正分选试剂盒进行磁珠纯化,用流式细胞分析仪分析其纯度,同时对入选患者行常规心电图、肺功能、心动超声及血气检查。同期16例性别、年龄无差异志愿者作为对照组,入选标准：年龄〈70岁;肺功能正常;没有临床症状;无吸烟史。结果：经过分离纯化可得到93％表达CD34^＋细胞。COPD患者组与对照组外周血中的CD34^＋细胞数分别是（19．99±11．11）×10^4、（32．75±18．25）×10^4,患者组CD34^＋细胞数明显少于对照组（P〈0．05）,CD34^＋细胞数与患者病程呈负相关（r=-0．689,P〈0．05）。结论：COPD患者外周血中CD34^＋细胞数降低,与患者病程呈负相关。     

小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的作用

目的：观察骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响。方法：体外培养骨髓内皮细胞株细胞,收集无血清条件培养液（命名为ECM）。用MiniMACS磁珠法分离脐血CD34+细胞。检测CD34+细胞经ECM体外液体培养24 h后或与骨髓内皮细胞层(ECL)共培养24 h后脐血造血细胞的扩增倍数,并观察在加入bFGF的培养条件下收集的骨髓内皮细胞条件培养液（bFGF-ECM）是否能加强对脐血造血细胞的扩增作用。 结果：ECM,ECL 皆能显著扩增脐血早期或晚期造血细胞,且二者对早期造血细胞的扩增效果是类似的;bFGF-ECM对脐血造血细胞的扩增倍数明显高于用ECM扩增的倍数。结论：小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞有明显的体外扩增作用。     

低温对人脐血内皮祖细胞的影响

目的将人脐血中分离培养出的内皮祖细胞进行低温保存和快速复苏,建立EPC细胞系,比较冻存前后细胞形态及生物学功能是否改变。方法采集人脐血,分离出单核细胞,对细胞进行冻存和复苏,测定内皮祖细胞增殖能力及黏附能力。结果内皮祖细胞经冻存和复苏后测得细胞的存活率为（84.17±4.02）%,细胞的形态学未见明显改变;与未冻存的细胞相比,刚复苏后即行增殖和黏附能力的检测,细胞的增殖和黏附能力有显著变化,P〈0.05;细胞复苏后继续培养48h行增殖和黏附能力检测,两者未见明显差异,P〉0.05。结论对低温保存后复苏的EPC,立即行增殖和黏附能力检测其能力均降低,复苏后继续培养48h再次检测未见明显差异。     

外周血内皮组细胞与脑梗死患者预后的相关性

目的：探讨脑梗死患者发病早期外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）与预后的关系.方法：以CD133和CD34标记的双阳性细胞作为EPCs,用流式细胞仪对108例急性（发病48 h）脑梗死患者（脑梗死组）、98例脑血管危险因素患者（危险因素组）、40名健康志愿者（对照组）的外周血EPCs进行计数检测.分别对脑梗死组发病48 h、梗死后21 d、梗死后90 d进行美国国立卫生研究院卒中量表评分（NIHSS）.结果：脑梗死组、危险因素组外周血EPCs均明显低于对照组（P〈0.01）.脑梗死组EPCs 亦明显高于危险因素组（P〈0.01）.NIHSS≥12分组较〈12分组的外周血EPCs明显降低（P〈0.01）.急性期外周血高水平的EPCs与脑梗死后21 d NIHSS改善程度（≥4分）密切相关（P〈0.01）,与脑梗死后90 d的良好预后独立相关（P〈0.01）.结论：脑梗死患者急性期外周血EPCs可作为脑梗死预后的一个独立预测指标.     

高血压患者循环内皮祖细胞改变与Ang-1／Tie-2表达的关系研究

目的研究Ang-1／Tie-2在高血压患者外周血中内皮祖细胞的表达及其调控意义。方法选择医院2012年原发性高血压患者30例为观察组,正常体检人群30例为对照组。测定外周血中内皮祖细胞数量和增殖活性,RT—PCR法和Western-blot法检测Ang-1／Tie-2表达。结果观察组内皮祖细胞数量和增殖活性为（6．17±0．89）×103／L和0．784-0．25,低于对照组（6．94±1．12）×103／L和1．14±0．36（P〈0．05）。观察组内皮祖细胞Ang-1和Tie-2的OD值分别为1．65±0．97和4．32±0．84,均低于对照组2．37±1．52和5．02±1．18（P〈0．05）;观察组内皮祖细胞Ang-1和Tie-2的蛋白表达分别为0．06±0．02和0．09±0．04,均低于对照组0．21±0．05和0．20±0．03（P〈0．05）。结论高血压患者内皮祖细胞数量减少,活性减弱,且内皮祖细胞上Ang-1／Tie-2表达下降,提示Ang-1／Tie-2通路的下调可能影响内皮祖细胞的修复功能。     

人脐血内皮祖细胞的体外培养

目的从人脐带血中分离内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源。方法采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养,采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs。结果脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;1周后既分化成EPCs,细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为（67.2±2.12）%,免疫组化CD34染色率为（89.67±2.05）%,流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定该细胞为EPSc。结论采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。     

苯磺酸左旋氨氯地平对高血压患者颈动脉内膜-中膜厚度和肉皮祖细胞的影响

目的研究苯磺酸左旋氧氯地平对高血压患者颈动脉内膜-中膜厚度（IMT）及内皮祖细胞（EPCs）的影响。方法选取30例确诊的高血压患者，均予左旋氨氯地平（2.5～5.0）mg／d口服治疗，随防8个月。采用高分辨率超声技术检测降压治疗前后的颈动脉IMT，并观察EPCs的数量和功能变化。结果30例患者均完成8个月随防，采用苯磺酸左旋氨氯地平治疗降压疗效明显，收缩压、舒张压均达标，颈动脉IMT明显降低，从治疗前的（1.07±0.06）mm降低到治疗后的（0．85±0.05）mm（P〈0．05），EPCs的数量和功能较治疗前明显改善（P〈0.05）．结论苯磺酸左旋氨氯地平降压疗效显著，能延缓颈动脉IMT增加，可改善EPCs的数量和功能，长期服用苯磺酸左旋氨氯地平有抗动脉粥样硬化作用。     

细胞因子参与下的脐血造血干细胞体外扩增

目的观察细胞因子参与下脐血干细胞体外扩增效果。方法用含15%胎牛血清改良细胞培养液,加入不同的细胞因子,设置1个对照组和3个实验组,分别于培养第0d、3d、7d、14d取培养液,台盼蓝染色计数单个核细胞的总数、流式细胞仪分析CD34＋细胞含量。结果与对照组相比,实验组单个核细胞的数量和CD34＋细胞的百分比均有显著增加,尤其以Ⅲ组（IL-3,6,2,4）第7d的扩增为最高：单个核细胞总数达（17.11±6.12）×109个/L,CD34＋细胞比率达（9.92±2.56）%。结论细胞因子可以提高脐血单个核细胞和CD34＋细胞的扩增效率,SCF＋IL-3＋6＋2＋4的组合在第7d时达到了最佳的扩增。