重组毕赤酵母生产干扰素α-2b的研究

目的为探求生产干扰素-α2b的方法。方法采用重组毕赤酵母发酵,纯化生产干扰素-α2b。结果重组毕赤酵母生产干扰素α-2b,产量高达70mg/L(发酵液),目标蛋白干扰素α-2b不需要复性,在纯化过程中,不需要价格昂贵的单抗柱,即可从发酵液中提取获得纯度达96%以上的目标蛋白,蛋白质比活性大于1.0×109IU/mg。结论PichiaPastoris高效酵母分泌表达系统取代大肠杆菌表达系统生产干扰素-α2b。结论采用重组毕赤酵母生产干扰素-α2b,能提高蛋白质比活性,简化生产工艺,降低生产成本。     

非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

通过正交设计对毕赤酵母GS115/pPICZaAN-hbsp工程菌的发酵条件(菌体密度、甲醇诱导浓度、初始pH值、诱导时间)进行优化.采用重组人骨唾液蛋白(recombinant lauman bone sialoprotein,rhBSP)单克隆抗体与Aldehyde-Resin HP FF介质偶联制备免疫亲和层析柱,纯化非融合型rhBSP,并用Western blotting和补体抑制实验检测非融合型rhBSP的抗原性和活性.毕赤酵母GS115/pPICZαAN-hbsp工程菌最佳发酵优化为:菌体密度OD600达到45甲醇诱导剂量为1.5%,pH值6.0,诱导时间2 d,最大表达量为0.126 mg/ml.经免疫亲和层析法纯化后,SDS-PAGE显示非融合型rhBSP为43～66 ku的分散条带,纯度在90%以上,Westernblotting显示rhBSP具有良好的抗原性,补体实验证明纯化的非融合型rhBSP活性很好.毕赤酵母GS115/pPICzαAN-hbsp工程菌发酵条件经优化后能高效表达非融合型rhBSP,应用免疫亲和层析方法纯化的非融合型rHBSP纯度好,活性高,为进一步研究非融合型rHBSP打下了基础.     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

重组人干扰素α2b大批量发酵条件的研究

目的 探索大批量发酵生产毕赤酵母菌所表达的重组人干扰素a2b的培养条件并确定诱导时间.方法 选用5L玻璃发酵罐作为人干扰素α2b发酵工艺研究系统,用30L不锈钢发酵罐做验证.探索了培养基中基础盐(Fermentation Basal Salts Medium FBS)的浓度对菌株生物量的积累和重组蛋白表达量的影响,并用确定了利用甲醇进行诱导的时间.结果 培养基中基础盐浓度在FBS原始浓度的60%左右时,菌株的细胞浓度及目的蛋白表达量均最好;诱导39h就可获得高表达.在优化工艺条件下,用30L罐放大,验证方法改进后对人干扰素α2b表达量的影响,此时总蛋白得量为600mg·L-1～800mg·L-1,与过去同样30L罐的表达量相比,增加了30%左右.     

重组人白细胞介素-11工程菌的诱导时机的选择

为了探讨诱导时机对大肠杆菌表达重组人白细胞介素-11蛋白的影响.在相同培养条件下.在不同的菌体密度时对工程菌进行诱导优化诱导时机.确定了相同的培养条件下的诱导时机.培养基配方：10g·L-1蛋白胨,5g·L-1酵母取物,8g· L-1氧化钠,1.6·L-1的Na2HP04,0.33g·L-1的KH2PO4,0.6g·L-1MgCL,Amp浓度0.1g·L-1维生素B1 0.02g·L-1,培荞中流加补料：N源（蛋白胨、酵母混合物）,葡萄糖.接种量10%,装液量30%,根据pH流加葡萄糖,按4/3流加葡萄的流速流加N源,IPTG诱导,诱导时问为4h,同时发酵三罐重复三批实验,结果衣明：在OD600为20左右时为最佳时机,工程均量（OD600）达44,重组人白细胞介素-11蛋白表达量为14%,为中试研究奠定了基础.     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化

目的研究重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白(Tα1-HSA)基因工程菌在30 L发酵罐中高密度发酵表达Tα1-HSA融合蛋白的发酵工艺及产物的分离纯化方法。方法采用两步发酵法进行重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌的高密度发酵。发酵液经超滤浓缩,阴离子交换色谱,亲和色谱,凝胶过滤色谱等步骤进行分离纯化。结果发酵结束后,菌体细胞湿重达到350 g/L,发酵液中蛋白产量达到2.0 g/L。发酵液经分离纯化后获得了纯度较高的重组Tα1-HSA融合蛋白,HPLC分析纯度达97.5%。结论重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度发酵的成功及分离纯化方法的建立为Tα1-HSA的进一步研究和开发奠定了基础。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

重组雪花莲外源凝集素(GNA)表达条件的优化

研究了含有GNA基因的重组大肠杆菌菌株G2和G3在不同诱导培养温度、起始诱导菌体密度(OD600值)、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导培养时间等重要因子对重组GNA表达的影响,以期获得重组GNA表达的最佳条件。实验结果表明,不含信号肽的G2菌株和含有信号肽的G3菌株的最佳培养条件分别为:起始诱导菌体密度为OD600≈0.6;诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L;诱导培养时间为6 h;G2和G3的诱导培养温度分别为37℃,28~30℃。该研究结果将为发酵生产重组GNA的工艺提供依据,也为重组GNA开发成为生物农药、试剂和免疫增强剂提供支持。     

重组人胸腺素α1融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人胸腺素α1（Tα1）融合蛋白在大肠杆菌中的表达量，研究了本实验室构建的pET39-Tα1重组质粒在E.coli BL21（DE3）宿主菌中的表达条件。经SDS-PAGE和凝胶成像系统GDS-8000分析结果表明，重组菌以LB为培养基，卡那霉素浓度为50mg／L，开始诱导时的菌体密度为（OD600=0．5，所加IPTG的浓度为0．5mmol／L，27．5℃摇床200r／min振荡诱导培养10h时，可在周至空间中获得高效表达的可溶的Tα1融合蛋白，占周质蛋白总量的64．7％，为下一步纯化工作提供了方便。     

基因重组毕赤酵母表达瑞替普酶的研究

对溶栓药物瑞替普酶在重组毕赤酵母中的表达进行了研究.摇瓶培养时,对pH、甲醇浓度和诱导相起始OD600 nm进行三因子四水平L16(43)的正交实验.结果表明,甲醇浓度的影响最显著.表达量最高的组合为A2B4C4,生长最好的组合为A2B4C2.验证实验显示,A2 B4 C4的表达量为7.72 mg/L,A2B4C2达到的干重为44.8 g/L.高密度培养结果表明.诱导相最佳甲醇浓度为4‰左右.此时,菌体各阶段的平均比生长速率μ均为最大,表达量也最高,为435.6 nag/L.同时,诱导相pH为6.5时rPA的表达量最高,达到487.0 rag/L.研究发现,pH为4.5和6.5时,39 ku、41 ku和60 ku的蛋白质间存在反对应关系,初步猜测它们之间可能存在某种修饰关系,需要进一步研究.     

人内皮抑素在毕赤酵母中的组成型表达及其活性检测

为获得大量具有生物学活性的重组人内皮抑素(Endostatin),在毕赤酵母中进行组成型表达的研究。将由毕赤酵母偏爱密码子组成的Endostatin cDNA插入组成型载体pGAPZαA中,构建表达载体pGAPZαA-ENDO,并转化到毕赤酵母X-33中。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型表达Endostatin蛋白。重组人Endostatin产量达到102mg/L。Western blot显示:表达蛋白能与兔抗Endostatin的多克隆抗体特异性结合。纯化后的重组Endostatin具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞增殖的活性。利用毕赤酵母组成型表达系统能获得大量具有生物活性的Endostatin蛋白。     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0%以上,生物学比活性高于1×108U.mg-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。     

Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化和性质研究

目的研究Kex2(EC.3.4.21.61)蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达、纯化和部分性质。方法 Kex2基因整合进p PIC9K质粒中,通过电转构建重组毕赤酵母GS115-Kex2,G418筛选多拷贝子,甲醇诱导得到目的蛋白。通过强阴离子交换层析Q-FF对重组蛋白进行纯化,对纯化后的蛋白进行酶学性质研究。结果通过毕赤酵母表达可以得到具有活性的重组Kex2蛋白酶,以Boc-Gln-Arg-Arg-p NA(叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺,Boc-QRR-p NA)为底物检测酶的活性,发酵外液活性达270U/L,SDS-PAGE检测目的蛋白的分子量为67k Da,经Q-FF纯化后,目的蛋白的活性回收率为84%。重组Kex2蛋白酶在p H 5.0~6.0之间稳定,p H 9.0时活性最高。在25℃,p H 5.0条件下放置12 h活力可保持88.2%。以Boc-QRR-p NA为底物,测得重组Kex2蛋白酶的Km值为0.0167 mmol/L,Vmax值为333.3μmol/min。结论利用毕赤酵母可成功表达分泌Kex2蛋白,经Q-FF纯化后可得到较纯的Kex2蛋白酶。     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的 优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法 构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果 制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0 %以上,生物学比活性高于1×108 U·mg^-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论 此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

高质量重组人干扰素α2b的分离纯化研究

重组人干扰素2b作为一种上市药物,被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗,产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的重组人干扰素以大肠杆菌基因工程表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素2b以包涵体的形式表达,包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低,纯化时需要经过四步色谱处理,工艺繁琐,成本高,而且无法去除未完全复性的中间产物,从而影响产品质量和疗效。建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺,并在此基础上,建立其高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵工艺优化获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵,收集菌体后,通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Octyl Sepharose Fast Flow疏水层析进行分离纯化,并对纯化产物进行生物活性分析。重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度A₆₀₀达到38.5,可溶性重组人干扰素α2b占...     

重组鼠干扰素α4在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的 本研究旨在获得稳定、高表达的重组鼠干扰素α4.方法 通过密码子优化对天然的鼠干扰素α4进行优化,采用全基因合成方法合成了rmIFNα4,构建了pPIC9k-rmIFNα4质粒,DNA测序无误后转至毕赤酵母GS115中,经蛋白表达筛选获得了稳定、高表达的基因工程菌.经离子交换柱层析及疏水凝胶层析纯化可获得rmIFN...