重组人表皮生长因子对牛品状体上皮细胞增殖的影响

目的观察重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)对牛晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)增殖的影响。方法体外培养牛LEC,在培养液中分别加入0μg.L-1、1μg.L-1、10μg.L-1、20μg.L-1、50μg.L-1、100μg.L-1、1000μg.L-1rhEGF,加药后72h采用MTT法,在酶标仪490nm波长处测定吸光度值并观测细胞增殖变化。结果0μg.L-1、1μg.L-1、10μg.L-1、20μg.L-1、50μg.L-1、100μg.L-1、1000μg.L-1的rhEGF作用于LEC72h后MTT法测得的OD值分别为0.166±0.029、0.195±0.017、0.232±0.034、0.263±0.019、0.315±0.009、0.261±0.005、0.206±0.043。结论rhEGF对牛LEC增殖有明显的促进作用,且呈浓度相关。     

rhEGF促进人结膜上皮细胞增殖的实验研究

目的：探讨rnEGF（recombinant buman epidermal growth factor)促进培养人结膜上皮细胞增殖的作用及最佳有效浓度,为提高眼表重建术后成功率寻找有效的治疗手段。方法：在传代人结膜上皮细胞中分别加入1μg/ml-100μg/ml浓度的rhEGF,于加药后第24、48、72、96h分别采用MTT法得出光吸收值以测定活性细胞数。结果：24hEGF各浓度组与对照组光吸收值无明显差异。48h50μg/ml、20μg/ml、10μg/mlEGF组光吸收值明显高于对照组,72h除100μg/ml组与其余EGF浓度组有显著性差异。结论：EGF对结膜上皮的增殖有明显促进作用,浓度为10－50μg/ml可以获得较好的效果。     

溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤细胞生长的影响

目的 研究溪黄草乙素对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞生长的影响.方法 MTT法测定不同浓度(5μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40μmol·L-1和80 μmol·L-1)和不同时间(分别作用24 h和48 h)溪黄草乙素对人Rb细胞株增殖的影响;碘化丙啶染色,流式细胞术观察溪黄草乙素对Rb细胞周期及细胞凋亡的影响.结果 溪黄草乙素各个剂量组对Rb细胞的增殖均有显著抑制作用,OD值随溪黄草乙素浓度升高而下降,抑制率随浓度增加而增加.溪黄草乙素对Rb细胞株的IC50为130 μmol·L-1,且随着溪黄草乙素剂量增加对Rb细胞株抑制作用增强.不同剂量组(对照组、5 μmol·L-1组、10 μmol·L-1组、20 μmol·L-1组、40μmol·L-1组、80 μmol·L-1组)溪黄草乙素作用Rb细胞24 h后,细胞凋亡率分别为:(1.07±0.03)%、(5.13±0.82)%、(8.67±1.20)%、(14.39±2.07)%、(26.45±3.01)%、(34.18±1.25)%;作用Rb细胞48 h后,细胞凋亡率分别为:(2.36±0.27)%、(6.49±1.15)%、(11.90±1.54)%、(19.21±2.66)%、(37.10±3.62)%、(47.55±3.19)%.表明溪黄草乙素作用Rb细胞24 h和48 h后Rb细胞的凋亡率在各个剂量组均显著升高,也呈现一定的剂量-效应关系,提示溪黄草乙素对Rb细胞凋亡率的影响随着剂量增加而升高.结论 溪黄草乙素可阻滞细胞进入C2/M期,进而诱导Rb细胞株凋亡.     

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞生物学行为改变及表达整合素连接激酶(ILK)的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)生物学行为及表达整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的影响.方法 组织块贴壁法培养原代HTFs,免疫荧光染色鉴定波形蛋白和角蛋白.MTT法检测不同浓度TGF-β2对HTFs细胞的促增殖作用,RT-PCR检测TGF-β2作用前后α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)、ILK mRNA的表达,Western Blot检测α-SMA、ILK、E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光染色检测α-SMA、E-cadherin蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,TGF-β2作用48 h、72 h,5.0 μg· L-1及10.0 μg· L-1诱导下的OD值显著高于0.1μg·L-1、1.0 μg·L-1组及空白对照组(均为P＜O.05),5.0 μg·L-1及10.0 μg·L-1作用48 h及72 h的OD值显著高于24 h(均为P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,5.0μg·L-1TGF-β2诱导48 h后,α-SMA mRNA及ILK mRNA水平和空白对照组相比明显上调,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).Western Blot检测结果显示,ILK、α-SMA及E-cadherin在空白对照组和5.0 μg· L-1TGF-β2处理组均有表达,但TGF-β2能够明显上调三者的表达,5.0 μg·L-TGF-β2处理48 h组与空白对照组差异均有统计学意义(均为P＜0.05).细胞免疫荧光染色结果显示,TGF-β2处理组α-SMA、E-cadherin均有荧光表达,其中oα-SMA表达在细胞质中,而E-cadherin在细胞质和细胞核中均有表达.结论TGF-β2可以诱导体外培养HTFs增殖,转分化及黏附性增强,同时促进ILK的高表达,提示ILK在青光眼术后瘢痕化过程中可能也起到一定作用.     

肿瘤坏死因子-α对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响及意义.方法 体外培养牛眼小梁细胞,免疫荧光法行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)及Ⅷ因子相关抗原染色鉴定.取第3代小梁细胞分别加入浓度20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1 TNF-α孵育35 h,免疫荧光法行FN染色后用激光共聚焦显微镜观测并行定量分析.结果 20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1浓度组染色积分光密度值分别为19 486.45±1 318.15、31 312.61±1 822.52、39 958.98±2 186.85,高于对照组积分光密度值(13 062.62±1 923.36).各实验组FN荧光强度表达高于对照组,差异具有统计学意义,且随TNF-α浓度增高FN的表达亦逐渐增多.结论 在体外培养条件下TNF-α可引起牛眼小梁细胞FN合成增加,推测FN可能通过与整合素结合来促进胶原收缩,小梁网间空隙扩大,房水外流阻力减小,从而降低眼压.     

去整合素抑制兔晶状体上皮细胞增殖的实验研究

目的 探讨去整合素(Kistrin)对兔眼后发性白内障发生过程中晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)增殖的抑制作用.方法 雄性新西兰大白兔36只,随机分为对照组:A组,实验组:B、C、D组,每组各9只兔9眼(右眼).4组均行透明晶状体囊外摘出术,术毕A组兔眼前房注入林格液0.2 mL,B、C、D组分别注入40 μg·L-1、80μg·L-1和160 μg·L-1 Kistrin溶液0.2 mL.术后第14天采用免疫组织化学法对4组兔后发性白内障发生过程中LEC增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达进行检测,计算增殖指数(proliferative index,P1)值,PI=PCNA阳性细胞数/50×100%;通过HE染色及透射电镜观察角膜改变情况.结果 (1)术后第14天PI值A组:0.320±0.020、B组:0.175±0.030、C组:0.065±0.020、D组:0.190±0.050,B、C、D组较A组PI值均明显降低(均为P＜0.01);C组较B、D组PI值均明显降低(均为P＜0.01),B组与D组PI值比较差异无统计学意义(P＞0.05);(2)术后第14天赤道部PI值A组:0.390±0.060、B组:0.230±0.040、C组:0.110±0.030、D组:0.240±0.080;中央部PI值A组:0.250±0.050、B组:0.120±0.030、C组:0.060±0.020、D组:0.140±0.040,4组赤道部较中央部PCNA阳性表达均明显升高(均为P＜0.01).(3)实验组C组与A组比较:角膜内皮细胞超微结构无明显改变.结论 40～160μg·L-1的Kistrin灌注液可有效地抑制制兔眼后发性白内障的发生;赤道部LEC增殖能力强于中央部;80μg·L-1可作为进一步研究Kistrin抑制后发性白内障形成的较适宜浓度.     

诺帝抑制糖基化白蛋白诱导的体外血管生成

目的 观察诺帝对糖基化白蛋白诱导体外血管生成的影响.方法 采用糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation bovine serum albumin,AGE-BSA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管生成模型,实验组设20 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1和200 μmol·L-1诺帝浓度,对照组为含50 mg·L-1 AGE-BSA的M199完全培养基,各组设24 h、48 h、72 h 3个时相点.通过增生细胞计数和小管样结构(tubule like structure,TLS)形成实验观察诺帝对AGE-BSA诱导的HUVECs增生和TLS形成的影响.结果 对照组和诺帝浓度分别为20 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1和200 μmol·L-1的各实验组HUVECs计数在24 h分别为(49.0±4.0)×103、(42.7±2.2)×103、(41.3±2.3)×103、(37.6±3.1)×103、(25.3±3.4)×103;在48 h分别为:(64.3±5.2)×103、(46.4±2.5)×103、(40.7±3.4)×103、(29.3±3.6)×103、(19.9±4.5)×103;在72 h分别为:(91.3±4.2)×103、(52.3±3.2)×103、(37.6±4.1)×103、(21.3±4.4)×103、(11.0±4.2)×103.TLS平均长度在24 h分别为:(11.92±0.98)mm·mm-2、(10.69±0.61)mm·mm-2、(6.29±0.34)mm·mm-2、(3.24±0.21)mm·mm-2、0;在48 h分别为(14.46±1.54)mm·mm-2、(10.93±0.74)mm·mm-2、(6.28±0.32)mm·mm-2、(1.34±0.41)mm·mm-2、0;在72 h分别为:(20.24±3.42)mm·mm-2、(11.59±0.45)mm·mm-2、(6 35±0.51)mm·mm-2、(0.28±0 26)mm·mm-2、0.各实验组HUVECs计数以及在胶原中形成TLS的长度均明显低于同期对照组(P<0.05).结论 诺帝能抑制AGE-BSA诱导的内皮细胞血管生成,提示诺帝可能对糖尿病视网膜病变血管生成具有抑制作用.     

前列地尔对体外培养类缺血再灌注损伤模型视网膜神经节细胞的影响

目的 探讨前列地尔对体外培养类缺血再灌注损伤模型视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)生长的影响及其作用机制.方法 以原代培养SD大鼠RGC为研究对象,将培养的细胞随机分为正常组、模型组、模型+前列地尔组.建立类缺血再灌注损伤模型,模型+前列地尔组在缺血期与再灌注期均加入浓度分别为15 μg·L-1、45 μg·L-1、135 μg·L-1前列地尔.类缺血模型建立后24 h、48 h、72 h应用MTT比色法分别测定各组细胞的吸光度值(A值),确定前列地尔的最佳有效作用浓度与时间;采用荧光定量PCR方法分别测定各组细胞中Bax、Bcl-2的相对表达量.结果 RGC培养48 h后,可见RGC伸出突起,随着培养时间的延长,细胞突起变长,部分细胞突起相互连接.使用抗大鼠Thy-1单克隆抗体对RGC进行细胞免疫组织化学检测,可见RGC胞浆及轴突染成棕黄色.模型建立后24 h、48 h、72 h时,与正常组、模型+前列地尔组比较,模型组A值均明显降低,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05);模型建立后24 h时,模型+45 μg·L-1前列地尔组A值与正常组差异无统计学意义(P＞0.05),而正常组、模型+45 μg·L-1前列地尔组与模型+15 μg· L-1前列地尔组、135 μg· L-1前列地尔组比较,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05),模型+15 μg· L-1前列地尔组与模型+ 135μg·L-1前列地尔组组间差异无统计学意义(P＞0.05);模型建立后48 h、72 h时,正常组、模型+前列地尔组之间A值差异均无统计学意义(均为P＞0.05).正常组Bcl-2的相对表达量为0.999±0.035,模型组为0.657±0.012,模型+45 μg·L-1前列地尔组为1.715±0.016(P ＜0.05);正常组Bax相对表达量为1.001±0.048,模型组为1.712±0.089,模型+45 μg· L-1前列地尔组为1.508±0.061(P ＜0.05).结论 前列地尔对体外培养类缺血再灌注损伤模型RGC具有保护作用;前列地尔可能通过上调细胞内Bcl-2的表达,同时下调Bax的表达,进而发挥细胞保护作用.     

去整合素对人眼晶状体上皮细胞的粘附移行作用

目的研究去整合素对体外培养的人眼晶状体上皮细胞生长的抑制作用。方法对先天性白内障患者术中环行撕前囊膜,进行原代培养并传代,取第2代细胞用于实验。抗粘附实验:将悬浮的细胞与不同浓度的去整合素(5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1)在37℃、50mL·L-1CO2条件下一起孵育30min。然后接种于涂有鼠尾胶原的96孔培养板。8h后,用HBSS轻洗各孔2次,MTT法测定粘附细胞的吸光度。抗移行实验:对融合的细胞进行划线,80μg·L-1的去整合素进行干预,24h、48h、72h后,细胞计数法观察裸露区内细胞的移行数量。结果不同浓度的去整合素(20μg·L-1、40μg·L-1、80μg·L-1)对晶状体上皮细胞的粘附均具有抑制作用且呈剂量依赖性。与对照组相比,24h、48h、72h内80μg·L-1的去整合素可显著抑制晶状体上皮细胞的移行。结论去整合素抑制体外培养的人眼晶状体上皮细胞的粘附及移行。     

氯通道阻滞剂NPPB对培养牛角膜内皮细胞增殖的抑制作用

目的观察氯离子通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenyl-propylamino)-benzoic acid,NPPB]对培养牛角膜内皮细胞增殖的作用。方法实验设5组,对照组,0.1%二甲基硫氧化物DMSO(di mathyl sulfoxide)组,50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1NPPB组。应用MTT比色分析法观察细胞增殖情况,计算细胞存活率。采用流式细胞仪检测细胞周期时相的变化,计算细胞增殖指数。结果NPPB使培养牛角膜内皮细胞MTT光吸收值和细胞存活率较对照组均显著降低,并具有浓度和时间依赖性。经100μmol·L-1NPPB处理48h后,与对照组相比,细胞出现明显的凋亡峰,G1期细胞比例明显增高,S期及G2期细胞比例则明显降低,增殖指数明显下降。结论NPPB能浓度依赖性抑制培养牛角膜内皮细胞的增殖,并使细胞停滞于G1期。