人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因, 获得其胞外段的原核表达产物.方法:采用RT-PCR方法, 从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA, 扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒, 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, 以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果:从健康产妇胎盘总RNA中, 扩增获得约1 300 bp的DNA片段, 克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN.从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因, 构建重组表达质粒pET- 41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST, 鉴定其相对分子质量( M r)为66 000, Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合.结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因, 并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST, 为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础.     

HIV-1 nef基因的克隆及原核表达研究

目的:构建HIV-1 Nef基因的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达,初步优化其表达条件。方法:利用特异性引物PCR扩增获得HIV-1 Nef基因片段,PCR产物经限制性内切酶双酶切后连接载体pET24a(+),构建重组质粒pET24a(+)-Nef。经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,优化表达条件,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物。结果:PCR扩增获得618bpDNA片段,酶切鉴定结果表明HIV Nef基因已克隆入原核表达载体pET24a(+)中,测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组菌诱导后可表达相对分子质量(Mr)符合预期的融合蛋白。0.1mmol/LIPTG在37℃诱导6h为最佳表达条件,重组蛋白表达量可由15.8%增加到43.9%。结论:在大肠杆菌中成功地表达了HIV Nef蛋白,并初步获得了最优化的表达条件。     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。     

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的 构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定.方法 采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌B121(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTA Agarose 纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17.IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体.结果 成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39 000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础.     

annexinA2基因片段的克隆、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法:从GenBank(BC093056.1) 中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码annexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白.表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot 鉴定.用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度.在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性.结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白.纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA 滴度达 1:640 000).CIF和 FCM 结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性.结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础.     

重组免疫毒素的纯化及鉴定

目的构建能特异性杀伤银屑病皮损中T淋巴细胞的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1。方法应用PCR扩增目的基因片段hIL2-Luffin P1,然后克隆到表达载体pET32a(+)中,并对重组质粒进行酶切鉴定及基因测序。测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21中,进行诱导表达。诱导表达正确的蛋白,经过蛋白的纯化、复性、脱盐、肠激酶酶切、再纯化,最后用兔抗人IL-2多克隆抗体对目的蛋白进行Western blot鉴定。结果构建了pET32a(+)-hIL-2-Luffin P1表达载体。最后得到了表达正确的hIL2-Luffin P1蛋白。结论重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为银屑病的治疗奠定了实验基础。     

HIV-1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备

目的:运用基因工程方法制备HIV-1 Nef重组蛋白及其抗体.方法:用PCR技术从HIV-1 H×B2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,将测序鉴定过的HIT-1 Nef基因克隆到原核表达载体pET28a( )上,应用酶切鉴定、测序、SDS-PAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞.结果:成功地构建了Nef基因的原核表达质粒,测序证明HIV-1 Nef基因全长为621 bp,编码206个氨基酸.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式.HIV-1 Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定.获得的高纯度HIT-1 Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶10000).将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性.结论:构建了高表达HIT-1 Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据.     

我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 N端片段的原核表达

目的 在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)N端片段.方法 应用PCR技术从含人MASP2 cDNA的质粒pGEM-MASP2中扩增MASP2-N端基因片段,将其克隆至pGEX4T-1原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP2-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与MBL-CLR结合的活性.结果 从pGEM-MASP2中扩增得到约840 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和840 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr 60 000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR蛋白结合.结论 获得了表达人MASP2 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP2N端片段/GST融合蛋白,为MASP2分子的进一步研究提供了条件.     

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段.方法:采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性.结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860 bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4 900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致.纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合.结论:获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件.     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

人GST-Cdc25C融合蛋白的原核表达、纯化及功能初步检测

目的:构建人Cdc25C基因原核表达载体,获得纯化的GST-Cdc25C融合蛋白,并对其功能进行初步检测。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Cdc25C基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Ros-sate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法检测融合蛋白表达,通过GSTpull-down技术检测纯化蛋白与已知结合蛋白Chk2的相互作用。结果:构建得到Cdc25C基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为80 000的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达,并纯化得到GST-Cdc25C融合蛋白,GST pull-down检测证实GST-Cdc25C蛋白可以和已知相互作用蛋白Chk2相互作用。结论:成功克隆Cdc25C基因,并获得了活性良好的GST-Cdc25C蛋白,为进一步研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。