HFCL细胞下调HL-60细胞cxcr4基因的表达及意义

目的:研究正常人骨髓成纤维样基质细胞HFCL对急性髓细胞白血病HL-60细胞cxcr4基因表达的影响及意义. 方法:采用流式细胞仪检测细胞周期,NBT还原实验和CD11b, CD14, CD13, CD33细胞表面抗原的测定作为细胞分化的指标;采用半定量RT-PCR, Northern blot检测cxcr4基因的表达. 结果:HL-60细胞与HFCL细胞共培养后,NBT阳性细胞增高,CD11b和CD14的表达增多,并有明显的统计学意义;而且cxcr4 mRNA的表达下调. 结论:HFCL细胞能诱导HL-60细胞部分向单核细胞分化,并使趋化因子受体cxcr4表达下调.     

正常骨髓基质细胞促进ATRA分化HL-60细胞的研究

目的 研究正常骨髓基质细胞(BMSCs)对全反式维甲酸(ATRA)诱导分化HL-60细胞的影响及其可能机制.方法 体外分离培养BMSCs,与HL-60细胞共培养.ATRA诱导悬浮的HL-60细胞分化,检测甲基蓝四氮唑(NBT)还原率,流式细胞仪测定CD11b、CD33抗原表达.结果 BMSCs与HL-60细胞共培养体系中,悬浮的HL-60细胞NBT还原率由原单独ATRA诱导分化的(84.36±4.22)%升高到(93.23±2.66)%(P＜0.05);CD11b表达由(65.97±3.18)%增至(90.54±0.97)%(P＜0.01);CD33表达由(78.79±0.83)%降至(52.25±2.21)%(P＜0.01).而基质细胞条件培养液(SCM)共培养体系中以上指标的差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs增强ATRA对HL-60细胞的诱导分化作用,并非通过分泌可溶性细胞因子,而可能是通过BMSCs与HL-60细胞间的相互作用,从而起到促进作用.     

大蒜油诱导HL-60细胞分化的实验研究

目的：观察大蒜油对HL-60细胞的诱导分化作用。方法：MTT法检测大蒜油对HL-60细胞的增殖抑制,Giemsa染色观察细胞形态改变,流式细胞术分析细胞周期改变,并检测CD11b、CD15的表达。RT-PCR检测bcl-2、c-myc／mad、mpo基因mRNA的表达。同时设ATRA、As2O3为阳性对照,与大蒜油的作用进行比较分析。结果：大蒜油明显抑制了HL-60细胞增殖,使大部分细胞阻滞于G0／G1期,作用强于ATRA和As2O3;诱导细胞成熟分化的能力与ATRA接近,优于As2O3;通过抑制bcl-2、c-mvc和mpo基因的表达,促进mad基因的表达来发挥作用。结论：大蒜油对HL-60细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用,有可能成为新的临床诱导分化剂。     

芳维A酸乙酯对HL-60细胞CD11b、CD15表达的影响

目的观察芳维A酸乙酯(arotinoid ethylester, AE)在HL-60细胞分化成熟过程中对其CD11b、CD15表达的影响,初步探讨AE治疗脓疱型银屑病的可能机制.方法 HL-60细胞以二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、全反式维A酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)、AE诱导培养,5 d后用流式细胞仪检测HL-60细胞表面CD11b和CD15的表达.结果 HL-60细胞经DMSO、ATRA、AE诱导后CD11b和CD15荧光标记率均比诱导前提高;ATRA组HL-60细胞CD11b和CD15荧光强度显著低于DMSO组,AE组HL-60细胞CD11b和CD15荧光强度显著低于ATRA组.结论 AE可明显抑制HL-60细胞表达CD11b、CD15;AE可能通过抑制参与炎症反应的中性粒细胞表达CD11b、CD15而降低中性粒细胞参与炎症反应的过程.     

重组人骨形成蛋白-2对正常人骨髓成纤维样基质细胞的影响

目的:研究重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL的影响。方法:Western Blot检测HFCL细胞PCNA表达的改变,并用软件对Western Blot结果进行密度扫描,计算量的变化。瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态变化和计算细胞核分裂像指数。流式细胞仪检测细胞周期及CD11b、CD14细胞表面抗原进一步鉴定细胞分化。结果:经过rhBMP-2作用24h后,HFCL细胞PCNA表达下降,经灰度扫描下降幅度为0.65倍;瑞氏-吉姆萨染色后发现细胞核分裂像减少,分裂指数下降,但细胞形态没有变化;HFCL细胞S期中的细胞数量减少,G1期数量增多,出现G1期阻滞;rhBMP-2作用没有使HFCL细胞向髓系或单核方向分化的趋势。结论:rhBMP-2可抑制HFCL细胞的增殖,但对HFCL细胞向髓系或单核方向分化影响不大。     

DRAM-1(自噬调控基因-1)慢病毒包装及对HL60细胞分化作用的研究

目的观察HL60细胞分化过程中DRAM-1变化,观察抑制DRAM-1表达对HL60细胞系分化的影响。方法 0.2×106/ml的HL60细胞系中加入维甲酸1μmol,分别在24h、48h、72h、96h流式细胞仪检测细胞表面CD11b表达,RT-PCR检测DRAM-1 mRNA、CEBPE、CSF3R表达。采用慢病毒转染293T细胞,收集培养液上清,感染HL60细胞,RT-PCR检测慢病毒感染后的DRAM-1 mRNA表达。结果 ATRA处理组较未处理组DRAM-1mRNA在HL60细胞系分化过程中表达明显增高。慢病毒感染细胞后,RT-PCR显示DRAM-1表达较对照组降低,等量ATRA处理,CD11b表达下降。结论 DRAM-1在HL60细胞系分化过程中表达增高。抑制DRAM-1表达阻碍HL60细胞系分化。     

二烯丙基二硫与全反式维甲酸合用对HL-60细胞的影响

目的探讨二烯丙基二硫（DADS）与全反式维甲酸（ATRA）联合用药对HL-60细胞生长抑制及诱导分化的影响。方法采用M1Tr、流式细胞术检测细胞周期及生长抑制，用HL-60细胞表面分化抗原CD11b及NBT实验检测HL-60的诱导分化作用。结果DADS与ATRA联合使用可以增加HL-60细胞的生长抑制率，并将HL-60细胞阻滞在G0/G1期。CD11b的表达和NBT实验结果表明两者合用对HL-60细胞的诱导分化作用与任何一种药物单独使用差异无显著性，但当两者剂量各自减少一半时，其诱导分化作用却增加，与任何一种药物单独使用时的诱导分化作用相似。结论DADS与AT—RA联合使用可以协同抑制HL-60细胞的生长，剂量减半合用时可协同对HL-60细胞的诱导分化作用。     

黄荆子乙酸乙酯提取物诱导HL-60细胞分化

目的:观察黄荆子乙酸乙酯提出物(EVn-50)诱导人急性髓性白血病HL-60细胞分化作用。方法:体外培养HL-60细胞,MTT法测定细胞活性;瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞分化形态学变化,间接免疫荧光显微镜观察细胞表面分化抗原CD11b表达。结果:EVn-50抑制HL-60细胞活性,其IC50值为6.29μg/mL,与全反式维甲酸(ATRA)10.35μg/mL相比较强;EVn-50具有诱导HL-60细胞向粒细胞系分化并表达分化抗原CD11b的作用,其阳性表达率呈剂量依赖性升高。结论:EVn-50具有诱导HL-60细胞分化的作用。     

期刊文摘

Mcl-1基因在HL-60细胞对全反式维甲酸耐药机制中的作用[付劲蓉,刘文励,周剑锋等.中华血液学杂志,2005,26(6):352～354]探讨髓系白血病-1(Mcl-1)基因在HL-60细胞对全反式维甲酸(ATRA)耐药中的作用。采用少量、递增、反复AT-RA诱导HL-60细胞,建立ATRA耐药细胞系HL-60/ATRA;利用鸡尾酒法制备Mcl-1基因的小片段干扰RNA(smallinterference RNA,si RNA),并通过脂质体介导将其导入HL-60/ATRA细胞;Western blot检测Mcl-1蛋白在细胞中的表达;MTF实验、NBT还原反应实验、TUNEL免疫组化染色法分别检测细胞的增殖、分化和凋亡情况…     

Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制

目的 将已构建验证成功的重组腺病毒Ad-NLS-RARα感染至HL-60细胞中,探讨其对HL-60细胞增殖及全反式维甲酸（ATRA）诱导的HL-60细胞分化的影响及机制。方法 将验证正确的腺病毒经Protamine sulfate辅助感染HL-60细胞,检测感染效率,用RT-PCR和Western blot检测目的基因在HL-60细胞中的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况。病毒感染HL-60细胞24 h后,用2.5 μmol/L ATRA处理,流式细胞术（FCM）检测细胞表面分化抗原CD11b的表达。RT-PCR和Western blot检测C-MYC基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果 在Protamine sulfate辅助感染作用下,重组腺病毒Ad-NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad-KZ对HL-60细胞的感染效率可达70%～80%。NLS-RARα基因的RT-PCR和Western blot结果显示,感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的HL-60细胞的NLS-RARα基因的mRNA及蛋白表达水平明显增高（P<0.05）。MTT法检测表明感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的细胞增殖能力增高 (P<0.05)。FCM检测结果显示,经ATRA处理后,感染Ad-NLS-RARα重组腺病毒的HL-60细胞,CD11b表达较阴性对照组和未感染组下调（P<0.05）。C-MYC基因的RT-PCR和Western blot检测结果表明,经ATRA 处理后,感染Ad-NLS-RARα重组腺病毒的细胞C-MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他两组(P<0.05)。结论 重组腺病毒Ad-NLS-RARα可以促进HL-60细胞的增殖,并通过上调C-MYC基因的表达,抑制ATRA诱导的HL-60细胞分化。     

急性白血病骨髓基质细胞对HL-60细胞增殖、分化的影响

目的 为探讨急性白血病骨髓基质对HL-60细胞的影响。方法 骨髓基质与白血病细胞共培养，采用MTT检测基质对白血病细胞的粘附，流式细胞仪检测粘附的HL-60细胞周期，非特异性酯酶及过氧化物酶染色观察白血病细胞分化及绘制白血病细胞生长曲线。结果 白血病骨髓基质对HL-60细胞的粘附率及粘附的白血病细胞处于G0／G1期比例均明显高于正常骨髓基质；正常骨髓基质对HL-60细胞的生长抑制作用及诱导分化作用均明显强于白血病基质。结论 急性白血病骨髓基质对HL-60细胞的增殖、分化作用均存在异常。     

Egr—1启动子库列调控造血生长因子表达的实验研究

目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法 该实验将携带Ｅｇｒ－１调控序列启动的ＦＬＴ３配基（ＦＬ）和ＧＭ－ＣＳＦ双顺反子载体（Ｅｇｒ－ＦＧ）导入骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ（称为ＨＦＧＬ／ＥＦＧ）。采用ＲＴ－ＰＣ、ＥＬＩＳＡ及细胞半殖法观察ＦＬ和ＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ在转染细胞中的表达及保护造血作用。结果 构建了Ｅｇｒ－１调控序列启动的双顺子反子基因表达载体（Ｅｇｒ     

NB4细胞和HL60细胞向粒细胞分化过程中细胞表面CD11b和CD18表达的比较

目的:比较髓系白血病细胞株NB4细胞和HL60细胞向粒细胞分化过程中细胞表面抗原CD11b和CD18的表达。方法:用全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞和HL60细胞向粒细胞定向分化,用MGG染色法进行初步鉴定,用FACS检测并比较两株细胞在分化前后细胞表面CD11b和CD18的变化,用Western blot检测两株细胞分化前后CD18的蛋白表达。结果:与分化前相比,两株细胞分化后细胞表面CD11b和CD18的表达均明显升高,并且这样的变化在NB4细胞中较HL60细胞更加显著。结论:分化NB4细胞可能较分化HL60细胞是更方便的粒细胞模型。     

正常人骨髓成纤维样基质细胞系对白血病细胞U937增殖的影响

目的 :观察正常人骨髓成纤维样细胞系HFCL对白血病细胞U937增殖的影响 .方法 :采用免疫组化对HFCL细胞进行鉴定 .建立U937细胞和HFCL细胞共培养体系 ,台盼蓝拒染法测定生长曲线 ;HE染色和瑞氏 吉姆萨染色后进行分裂指数 (MI)测定 ;流式细胞仪 (FCM)检测细胞周期的变化 ;WesternBlot检测增殖细胞核抗原 (PCNA)表达 .结果 :与单独U937细胞培养相比 ,与HFCL细胞共培养后 ,U937细胞生长受抑 ,且与HFCL细胞直接接触组的抑制作用大于用transwell组 .其分裂指数单独白血病细胞组 >用transwell组 >与HFCL直接接触组 .细胞周期分析发现U937细胞与HFCL细胞共培养后 ,G1期细胞增高 ,S期细胞减少 ,以直接接触组为甚 .与HFCL细胞共培养后 ,U937细胞的PCNA表达下调 ;而与U937细胞共培养 ,HFCL细胞生长和细胞周期无明显变化 .结论 :正常人骨髓成纤维样细胞HFCL能抑制白血病细胞U937的增殖 ,阻止U937细胞细胞周期的运行 ,而U937细胞对HFCL细胞的生物学特性影响不大     

全反式维甲酸诱导HL60细胞分化前后蛋白表达差异分析

目的:建立全反式维甲酸(All trans-retinoic acid,ATRA)诱导HL60细胞向粒系分化的模型,研究采用改良双向电泳条件对分化前后的细胞全蛋白进行分离分析,寻找差异表达蛋白.方法:采用全反式维甲酸对HL60细胞进行诱导分化.通过MTT、流式细胞技术分析细胞增殖情况和CD11b细胞表面分化抗原的表达,选择最适的药物浓度和诱导时间;再通过细胞化学染色对分化结果进行验证,构建分化模型.采用改良双向电泳分离技术对细胞全蛋白进行分离,运用PDQuest软件分析HL60细胞分化前后蛋白表达差异,并用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF)对差异蛋白点进行分析.结果:ATRA明显抑制HL60细胞增殖,并随药物浓度的增加,抑制效果也越显著;2 μmol/L的ATRA连续作用HL60细胞5 d即有90%以上的细胞有粒系分化标志抗原CD11b的表达.细胞化学染色结果亦表明诱导后的HL60细胞向粒系分化.将分化前后的HL60细胞全蛋白经过改良双向电泳技术分离,PDQuest软件比对,MAIDI-TOF分析,发现有25个蛋白点仅在未分化凝胶谱中找到,有15个蛋白点仅在分化细胞蛋白表达谱中找到.其中有的是癌基因表达蛋白,有的是抑癌基因表达蛋白,还有的则参与凋亡过程等.结论:在选定的药物浓度和作用时间下,ATRA可以诱导HL60细胞向粒系分化.改良双向电泳技术对药物作用前后细胞蛋白的分离,可发现不同于传统双向电泳分离所得的蛋白结果.     

BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的: 将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础。方法: 分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;实验组应用已构建的pEGFP-N1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western 印迹分析;将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析。结果: 流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+), CD34(-)、CD45(-);经Western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用。     

氟尿嘧啶诱导Egr-1启动子调控造血因子基因表达对造血恢复的影响

目的 探索5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导Egr-1启动子调控造血生长因子基因表达对化疗后造血损伤的恢复作用.方法 构建携带Egr-1调控序列启动的GM-CSF和EGFP双顺反子基因pCIneo真核表达载体(Egr-EG);通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL,挑出G418抗性的阳性克隆(HFCL/EG);采用流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察EGFP绿色荧光表达的阳性细胞;在加入5-Fu的HFCL/EG细胞培养体系中,采用RT-PCR、Western印迹和ELISA检测GM-CSF的表达;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸鉴定化疗通过活性氧诱导Egr-1启动子CarG 序列调控下游基因表达的特异性.将HFCL/EG细胞输入荷瘤的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内,对其实施5-Fu化疗,观察外周血象动态改变和对肿瘤的影响.结果 构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体(EgrEG);在HFCL/EG细胞中证实有外源性基因EGFP和GM-CSF的表达,在5-Fu处理后HFCL/EG细胞培养上清液GM-CSF含量较未加5-Fu组明显增高(P＜0.01);RT-PCR和Western印迹显示化疗后HFCL/EG细胞GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强.在5-Fu处理的HFCL/EG细胞中,N-乙酰半胱氨酸明显减少GM-CSF含量.实验组与对照组相比外周血白细胞下降幅度明显减轻,恢复加快,而各组间肿瘤抑制率与化疗组相关,而与外源基因表达无明显的差异.结论 5-Fu诱导Egr-1启动子调控的造血生长因子基因表达对化疗后的造血损伤具有一定的恢复作用.