脑源性神经营养因子基因修饰的嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓的保护作用

我们以重组缺陷型腺病毒为载体，将脑源性神经营养因子（BDNF）基因转染的嗅鞘细胞移植入大鼠损伤的脊髓，观察脊髓修复和肢体功能恢复情况，为将来应用基因工程细胞移植治疗脊髓损伤提供依据。     

神经生长因子和脑源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞和胚胎脊髓细胞悬液植入促进大鼠脊髓损伤修复的研究

目的从转基因角度探讨治疗脊髓损伤的有效性。方法用改良Allen打击法制作脊髓损伤动物模型,1周后将神经生长因子nervegrowthfactorNGF和脑源性神经营养因子brainderivedneurotrophicfactorBDNF基因修饰的雪旺细胞(Schwanncells,SCs)和胚胎脊髓细胞悬液(fetalspinalcordcellsuspension,FSCS)移植联合植入脊髓损伤部位,1个月和3个月后用免疫组化方法观察神经丝蛋白NF、胶质纤维酸性蛋白GFAP、髓基质蛋白MBP、5-羟色胺5HT、NGF和BDNF的变化,并根据图像分析各实验组的免疫阳性反应变化;通过光电镜观察脊髓组织形态学改变。结果将转NGF和BDNF基因的SCs与FSCS联合植入脊髓损伤部位有以下优点:1移植物能很好地与宿主融合和存活,2能发挥FSCS的“桥接”、“中介”作用,3SCs可以起到神经轴突的“导管”、“导向”作用,4神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs)NGF和BDNF可以刺激轴突的生长和挽救受损的神经元。结论将NGF和BDNF基因修饰的SCs和FSCS移植联合起来,让局部释放的NTFs不断刺激、引导宿主纤维和移植物的整合与联系,以促进脊髓损伤的修复。此方法为将来治疗脊髓损伤提供线索。     

脑源性神经营养因子基因修饰神经干细胞对体外培养的脊髓背根神经节细胞的生物学作用

目的建立稳定表达脑源性神经营养因子(BDNF)基因的神经干细胞并观察其对于体外培养的脊髓背根神经节(DRG)细胞存活及突起生长的影响。方法以PCR技术从人脑cDNA文库中获取人BDNF基因片段。采用分子克隆技术构建带有绿色荧光蛋白报告基因的多顺反子的MSCVBDNFIRES2EGFP重组鼠干细胞病毒表达载体,病毒经PT67细胞包装后感染神经干细胞株C17.2。通过免疫组化,RTPCR,ELISA检测BDNF的表达,在双室共培养系统中共培养3,10d后观察经筛选的稳定表达株对原代培养DRG细胞的生物学作用。结果RTPCR证实BDNF基因在C17.2细胞中转录,ELISA分析显示转基因C17.2培养上清中在转染24h后即可检测到BDNF表达,并在3个月后仍表达(14.6±0.8)ng·d-1·10-1细胞;免疫细胞化学显示,与对照组相比较,BDNF基因修饰的神经干细胞组,DRG细胞突起生长较长交织呈网状的,节细胞存活较多。结论干细胞病毒介导转染的BDNF基因能够在神经干细胞C17.2中稳定表达,并且BDNF基因修饰的神经干细胞对体外培养的DRG细胞的存活及突起、延伸具有显著促进作用。     

神经干细胞移植促进脊髓损伤后脑源性神经营养因子的表达

目的：探讨神经干细胞（NSCs）移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响及其意义。方法：NSCs提取自新生Wistar大鼠的海马区，经培养、鉴定。制作大鼠脊髓损伤（SCI）模型，于伤后第7天移植NSCs。实验分为3组：NSCs移植组（A组），DMEM填充组（B组），正常对照组（C组）。应用RT—PCR法和免疫组化法观察细胞移植后BDNF基因表达的变化。结果：RT—PCR结果分析，移植术后第1、3、5天，A组BDNF mRNA的表达量明显高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。组化结果分析，移植术后第7、14、28天BDNF的表达量A组明显高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：NSCs在移植后可上调脑源性神经营养因子BDNF基因的表达，是其修复脊髓损伤的机制之一。     

脑源性神经营养因子基因修饰脂肪间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰脂肪间充质干细胞(ADSCs)治疗大鼠急性脊髓损伤效果.方法 获取大鼠ADSCs细胞,观察其生物学特征,行溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记及腺病毒BDNF基因转染.将36只SD大鼠随机分为3组:脊髓损伤对照组(A)、ADSCs治疗组(B)及BDNF转染的ADSCs治疗组(C).在脊髓损伤部位行相应处理:A组植入明胶海绵;B组植入含3.0μl(3×1010/L) ADSCs的明胶海绵;C组植入含3.0μl(3×1010/L)转染ADSCs的明胶海绵.行为学评分及观察免疫荧光染色.结果 成功分离并培养ADSCs,可于体外稳定增殖.术后7、14、28 d,C组运动功能评分为(10.55±0.80、14.39 ±0.25、19.71 ±2.14)分,明显高于A组(5.35 ±0.68、7.93±0.45、10.78 ±1.18)分、B组(7.01 ±0.39、10.33±0.27、14.87 ±0.37)分.免疫荧光染色显示移植ADSCs脊髓组织内,均可见不同程度的分布有BrdU阳性标记细胞;荧光染色结果提示部分BrdU阳性的移植细胞同时呈胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性.结论 ADSCs在移植后能在宿主体内存活、迁移并分化.移植ADSCs之后,运动功能可见改善,证实ADSCs移植能改善中枢神经系统功能.     

胶质细胞源性神经营养因子和肿瘤坏死因子可溶性受体基因修饰的神经干细胞联合移植治疗脊髓损伤的实验研究

目的探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和肿瘤坏死因子可溶性受体（sTNFR）腺病毒感染的人神经干细胞移植治疗脊髓损伤模型的可行性。方法先包装和扩增含GDNF和sTNFR基因的重组腺病毒，然后用该腺病毒感染人神经干细胞，再将这些神经干细胞移植到脊髓损伤局部。实验动物与分组：雄性sD大鼠，A组：hGDNF和sTNFR转基因神经干细胞移植组；B组：空病毒转基因神经干细胞移植组；c组：神经干细胞移植组；D组：只横断脊髓，不作移植；E组：对照组，只咬除棘突和椎板，不横断脊髓，不做其他处理；F组：不作任何处理。免疫组化检测外源基因的局部表达，最后进行组织学检查和BBB功能评分。结果免疫组化显示局部有外源基因表达，A组BBB功能评分优于C组，但组织学结果未见明显优势；这两组BBB评分显著优于阴性对照组，组织形态也有明显改善。结论腺病毒介导的GDNF和sTNFR基因修饰的神经干细胞移植是一种较好的脊髓损伤治疗方法。     

胶质细胞源性神经营养因子和脊髓损伤修复

脊髓损伤（SCI）后神经功能恢复因脱髓鞘作用、轴突的断裂、神经细胞的死亡、胶质疤痕等而受到限制。目前有多种方法可以促进脊髓功能恢复，但效果均不理想。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）家族作为神经营养因子的一种，具有功能强大的神经营养作用。随着近年不断深入的研究，GDNF越来越多的功能作用被发现，对神经系统的发育成熟以及对神经损伤后的神经功能恢复．发挥着极其重要的作用。笔者就其在促进脊髓损伤恢复方面的研究做一综述。     

胶质细胞源性神经营养因子与脊髓损伤治疗

脊髓损伤治疗是医学界的热点和难点,从传统的大剂量激素冲击、手术解除压迫、术后康复锻炼等到干细胞移植、基因疗法等均未取得满意效果.大量研究证实,胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)有促进脊髓损伤修复的作用,为脊髓损伤治疗带来新方法.该文就GDNF结构特性及在脊髓损伤修复中的作用研究进展作一综述.     

脑源性神经营养因子在急性脊髓损伤后神经修复中作用的研究进展

脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF）是在脑内合成的一种蛋白质,并且广泛分布于中枢神经系统内。它属于神经营养因子的一种,对神经系统的生长发育和成熟有重要的影响。本文就BDNF及其受体的分子结构、功能、影响因素及在急性脊髓损伤后神经修复方面的研究现状和应用前景做一综述。     

胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用

神经营养因子 (ＮＴＦｓ)在神经再生、突触形成以及神经损伤修复过程中起着重要的作用[1] 。胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子[2 ] 。本实验旨在观察外源性ＧＤＮＦ对大鼠脊髓急性压迫损伤后神经元的保护作用。一、材料与方法1.重组人ＧＤＮＦ、神经生长因子(ＮＧＦ) :第一军医大学神经生物教研室提供 ,纯度大于质量分数 90 % ,浓度为 1ｇ/Ｌ。2 .实验动物及分组 :体重 2 5 0～ 3 0 0ｇ的雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ大鼠 45只 ,随机分为 3组 :生理盐水 (ＳＡＬ)组、ＧＤＮＦ组和ＮＧ…     

大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的实验研究

目的观察大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡现象,检测脊髓损伤后凋亡相关基因的表达。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1N1波幅下降至术前波幅70%后,分别于术后30min、6h、1、4、7、14、21d处死大鼠,取材(n=4)。应用流式细胞仪、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)技术观察脊髓细胞凋亡情况,用免疫组化检测p53、bax和bcl2的表达。结果流式细胞仪及TUNEL法检测显示,损伤组术后6h凋亡细胞开始增多,术后7d细胞凋亡率达高峰,随后开始回落,持续21d,与空白对照组及椎板切除组比较,差异有显著性意义(P<005,001)。TUNEL法染色显示,白质中出现大量胶质细胞凋亡。免疫组化染色显示损伤组术后6h开始,p53、bax和bcl2阳性表达开始增多,p53阳性细胞数术后4d达高峰,bax和bcl2术后7d达高峰,损伤组各时相点的阳性表达与空白对照组与椎板切除组比较差异有显著性意义(P<005,001)。结论牵张性脊髓损伤后存在细胞凋亡现象,从形态上看包括神经元和胶质细胞凋亡,细胞凋亡是牵张性脊髓损伤继发损害中细胞死亡的一种重要形式,也是继发损伤期的重要病理变化。凋亡相关基因p53、bax大量表达,可能在脊髓细胞凋亡过程中起重要作用。     

Protective effect of liposome-mediated glial cell line. derived neurotrophic factor gene transfer in vivo on motoneurons following spinal cord injury in rats

IDepartmentofOrthopedicandSpineSurgery ,NanfangHospital,FirstMilitaryMedicalUniversity ,Guangzhou 5 10 5 15 ,China (LuKW ,ChenZYandHouTS) Correspondingauthor:Tel:86 2 0 6 136 0 0 4 6 ,E mail:lukaiwu @sohu .comThisworkwassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina (30 0 0 0 0 4 8)andtheNationalBasicResearchProgram (G 19990 5 4 0 0 0 )ofChina.nrecentyears ,substantialevidencehassuggestedthatearlyadministrationofexogenousneurotrophicfactors (NTFs)intoinjuredregioncanfacilit…     

大鼠脊髓损伤后腓肠肌GDNF基因表达及意义

目的 探讨大鼠脊髓损伤后,后肢肌GDNFmRNA表达的变化及其意义。方法 选用SD雄性大鼠30只,根据脊髓损伤时间随机分为5组。即伤前,伤后3、7、10及21天组。采用Allen‘s方法致大鼠脊髓T13段不完全性损伤,以β-Actin为内参照物,半定量RT-PCR方法,观察大鼠腓肠肌在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达。结果 脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠腓肠肌微量表达。脊髓损伤后3天表达上调至3倍,7天上调至10倍,10天上调至4倍,21天仍高于正常水平。结论 脊髓损伤后骨骼肌GDNFmRNA表达上调,可能是神经元通过“胞体-轴突-靶器官”途径的一种自我保护反应,用GDNF治疗脊髓损伤时应长期用药。     

嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓组织中BDNF表达的影响及意义

目的 观察嗅鞘细胞(OEC)移植治疗大鼠脊髓损伤的作用以及脊髓损伤组织中脑源性神经营养因子(BDNF)表达的变化,从神经营养因子角度探讨OEC移植修复脊髓损伤的机制.方法 分离和培养绿色荧光蛋白转基因大鼠的OEC,备移植用.取SD大鼠制备脊髓损伤模型,用随机数字表法将建模成功后的SD大鼠分为2组.实验组:建模成功后立即进行OEC移植,移植部位为脊髓损伤处及其首尾正中血管的左右两侧;对照组:用DMEM/F12培养液替代OEC悬液,操作同实验组.移植后对各组大鼠的运动功能进行评分,每周1次.采用实时逆转录聚合酶链反应检测BDNF mRNA的表达,采用免疫组织化学法检测BDNF蛋白的表达,取正常SD大鼠BDNF mRNA和蛋白的检测水平作为正常对照.结果 移植后两组大鼠的运动功能均逐渐改善,移植后21 d时,实验组大鼠运动功能评分明显高于对照组(P＜0.05).移植后OEC存活良好,实验组损伤的脊髓组织周围分布有大量的呈绿色荧光的OEC.移植后21 d时,实验组BDNF mRNA和蛋白的表达水平显著高于对照组和正常对照组(P<0.05),而对照组也显著高于正常对照组(P<0.05).结论 OEC移植可明显修复大鼠的脊髓损伤,其机制可能与OEC通过增强损伤脊髓组织中BDNF mRNA和蛋白的表达,改善局部微环境有关.

Abstract：

Objective To observe the expression of brain-derived neurotrophical factor (BDNF) in injury spinal cord after transplantation olfactory ensheathing cells (OECs), and to investigate the mechanism of OECs repairing spinal cord injury.Methods OECs from GFP transgenic rats were separated and cultured for transplantation. Spinal cord injury rats were separated two groups by random digits table. In experimental group, OECs suspension were transplanted into injured spinal cord following spinal cord injury. In control group, DMEM was transplanted into the injured spinal cord after spinal cord injury. Motor function was evaluated per week after transplantation. The expression levels of BDNF mRNA and protein were detected by using RT-PCR and immunohistochemistry respectively, and compared with those from normal SD rats.Results Motor function of two groups was improved gradually after transplantation. The motor function scores in experimental group was obviously higher than in control group at 21st day after transplantation (P<0.05). A lot of survival GFP OECs distributed around impaired myeloid tissue. At 21st day after transplantation, BDNF mRNA and protein expression in experimental group were strongest (P<0.05), and stronger in control group than in normal group (P<0.05).Conclusion The transplantation of OECs can repair the injured spinal cord by increasing the expression of BDNF mRNA and protein to improve local microenvironment.     

脊髓干细胞移植对脊髓损伤后神经功能的影响

目的探讨胚胎脊髓神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的意义。方法160只SD大鼠随机分为空白组,假手术组,脊髓损伤组,细胞移植组,分别在细胞移植后1、2、4周应用斜板实验和Tarlov评分对脊髓损伤后功能恢复进行评价,应用nestin标记观察移植后干细胞的存活情况。结果移植后1周、2周、4周,移植组和对照组斜板试验结果分别为(38．30±0．84)°、(18．50±0．76)°；jm(39．40±0．78)°、(19．70±0．66)°；(45．00±0．81)°、(22．30±0．69)°；Tarlov评分分别为3．37±0．45、2．32±0．34；3．45±0．38、2．41±0．43；3．63±0．47、2．45±0．48；有统计学意义(P＜0．01),免疫组织化学观察可见在损伤的脊髓组织中有神经干细胞的存活。结论胚胎脊髓干细胞移植对脊髓损伤后神经功能恢复有促进作用。     

一种改良方法构建大鼠脊髓损伤体外细胞模型

目的 探讨大鼠脊髓神经细胞原代培养、鉴定的方法并构建大鼠脊髓损伤体外细胞模型.方法 取孕15dSD大鼠胚胎,分离脊髓组织并采用改良的胰酶消化联合机械分离法进行脊髓神经细胞的原代培养;采用免疫荧光三标染色鉴定脊髓神经细胞;应用H2O2干预构建大鼠脊髓损伤体外细胞模型.结果 取孕15d大鼠胚胎采用改良的胰酶消化联合机械分离...     

大鼠脊髓损伤后GDNFmRNA表达变化及意义

目的　探讨 GDNFm RNA在大鼠脊髓损伤后表达变化及其意义。方法　改良 Allen’s脊髓撞击 (10 g× 7.5 cm)致伤大鼠 T1 段脊髓 ,以 β- Actin为内参照物 ,应用半定量 RT- PCR方法 ,观察大鼠脊髓损伤前及损伤后不同时间 GDNFm RNA表达变化。结果　 GDNFm RNA在正常成年大鼠脊髓微量表达 ,脊髓损伤后 2 4h表达增加 5倍 ,72 h增加 2 0倍 ,7d增加 4倍 ,10 d仍高于正常水平。结论　脊髓损伤后早期 GDNFm RNA表达增加 ,是神经元自我保护作用的一种表现 ;损伤神经元修复需要大量 GDNF,应用 GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药     

神经干细胞单细胞与神经球治疗大鼠脊髓损伤的对比研究

目的比较神经干细胞(neural stem cells,NSCs)单细胞与神经球移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)的效果,研究两种NSCs移植方法治疗SCI的有效性。方法取成年SD大鼠2只,体外分离脊髓组织并行NSCs培养,取第3代细胞行Hoechst33342、巢蛋白染色及贴壁分化鉴定。另取成年SD大鼠(体重230～250 g)60只,随机分为3组,每组20只,采用改良Allen法制备大鼠脊髓T10损伤模型。各组分别于SCI处缓慢注射5μL生理盐水(A组)、第3代NSCs单细胞(B组)、第3代NSCs神经球(C组)。分别于术前及术后3、7、14、21、28 d采用BBB行为功能评定量表评定各组大鼠后肢功能;术后各时间点取材行HE染色和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)免疫组织荧光染色观察。结果经形态学观察及鉴定,所培养的细胞为NSCs。术后3 d各组BBB评分较术前显著下降,术后3、7 d各组间BBB评分比较差异均无统计学意义(P>0.05);随时间延长BBB评分不同程度增加,术后14、21、28 d,B、C组BBB评分优于A组,C组优于B组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色示C组较A、B组脊髓结构清晰,瘢痕形成少。MAP-2免疫组织荧光染色示,术后3、7 d各组间阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P>0.05);术后14、21、28 d,B、C组阳性细胞数显著多于A组,C组多于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用NSCs神经球移植较单细胞移植更明显促进NSCs向神经元分化,更有利于SCI后下肢功能恢复。     

胶质细胞源性神经营养因子体内转基因对皮质脊髓束再生的影响

目的通过非病毒载体阳离子脂质体介导,探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因体内转染对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生的影响.方法采用NystrOm法制备大鼠胸髓后路压迫损伤模型,压迫重量为50 g,时间为5 min,造成大鼠胸段脊髓急性重度损伤.用微量注射器将阳离子脂质体DC-Chol 6μl和重组质粒pEGFP-GDNF cDNA 2μg混合后注入大鼠损伤脊髓.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因后在局部的表达,通过辣根过氧化物酶(HRP)顺行追踪技术和神经微丝(NF)免疫组织化学活性的变化来评价GDNF基因体内转染对大鼠皮质脊髓束再生的影响.结果 GDNF基因体内转染1周后显示在基因注射局部有转录和蛋白水平表达.脊髓损伤后4周在损伤区可见较多的皮质脊髓束再生,损伤区NF阳性轴突数(524.33±80.55)/低倍视野较对照组(309.84±56.65)/低倍视野明显增多(P＜0.01).结论阳离子脂质体介导GDNF体内转基因能促进近端皮质脊髓束再生和神经骨架蛋白的修复.     

GDNF基因修饰的嗅鞘细胞移植联合IN-1注射修复大鼠急性脊髓损伤

目的 研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的嗅鞘细胞(OECs)移植联合轴突生长抑制蛋白抗体(IN-1)局部持续注射对大鼠急性横断性脊髓损伤(SCI)的修复作用.方法 构建载有GDNF基因的慢病毒(Lentivirus)载体并体外转染OECs,Western Blot检测GDNF的表达.用50只成年雌性SD大鼠建立胸脊髓全横断损伤模型,随机分为A(对照组)、B(IN-1微泵注射组)、C(OECs组)、D(GDNF-OECs组)和E(GDNF-OECs+IN-1组)5组各10只.应用神经丝蛋白200(NF200)单抗免疫组化、生物素化的葡聚糖胺(BDA),顺行神经追踪对SCI区神经纤维再生进行形态学观察.采用BBB评分评估大鼠后肢功能恢复情况.结果 术后共有13只大鼠死亡.术后8周可观察到Hoechst标记的OECs在体内存活并在脊髓内迁移;E组和D组可见SCI区杂乱无序的再生轴突,有连续性神经纤维通过损伤区;C组可见少量无序的再生轴突,可疑连续性神经纤维通过损伤区;B组和A组脊髓残端萎缩,未见轴突再生.A、B、C、D和E组后肢功能运动平均BBB评分分别为7.70±0.24、7.89±0.15、10.50±0.25、11.43±0.23和12.81±0.40.结论 GDNF-OECs移植联合IN-1抗体注射可有效促进损伤脊髓神经轴突的存活、再生,促进损伤脊髓的修复.