RNA干扰抑制EphA2癌基因在结肠腺癌HCT-8细胞系中的表达

目的利用RNA干扰（RNAi）技术抑制EphA2癌基因在结肠腺癌HCT-8细胞系中的表达,以期为肿瘤的基因治疗提供新的思路和手段。方法构建逆转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,应用逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制EphA2癌基因在结肠腺癌细胞HCT-8中的表达,同时利用Western免疫印迹和免疫组织化学SP法分别检测转染后HCT-8细胞中EphA2蛋白的表达水平。结果从EphA2 mRNA序列中筛选出有效的siRNA序列,并设计了互补双链寡核苷酸发夹结构,成功构建了EphA2 siRNA的逆转录病毒表达载体,重组逆转录病毒载体pSIREN-EphA2经酶切鉴定结果正确;测序分析证实插入的EphA2 siRNA的方向及序列正确。Western免疫印迹和免疫组织化学方法分析,与对照空载体及未转染细胞相比,重组pSIREN-EphA2转染的HCT-8细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．001）。结论通过逆转录病毒载体介导的RNAi能够抑制HCT-8细胞中EphA2的蛋白表达,为以EphA2为靶向的结直肠癌的基因治疗提供了新的思路和手段。     

可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达

目的构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE。方法将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE。将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVKHBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案。     

KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNAi)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱导RNAi,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,RT-PCR,Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化.采用阳离子聚合物纳米粒In vivo jetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤,监测肿瘤生长变化,RT-PCR,免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化.结果:靶向KDR基因siRNA转染MCF-7后,细胞增殖被抑制,KDRmRNA和蛋白的表达明显降低;裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR,免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调.各对照组指标无明显变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法,而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点.     

人巨细胞病毒感染对小鼠脑组织同源框基因表达的影响

目的　研究小鼠脑组织同源框基因 (homeoboxgene ,Hox)的表达状态及人巨细胞病毒(humancytomegalovirus ,HCMV)感染对小鼠脑组织Hox基因表达的影响 ,以探讨HCMV致畸的分子机制。方法　昆明系小鼠 4 8只 ,随机分为 :实验对照组 (16只 )和病毒感染组 (32只 ) ,病毒感染为脑内注射。在感染后 7、15、30、6 0d分别以病理学方法观察病理损伤 ,以免疫组化方法检查HCMV LA(latean tigen) ,PCR检测小鼠脑组织中HCMV DNA。在建立HCMV脑部感染的小鼠模型基础上 ,用RT PCR测定Hox基因在病毒感染组和实验对照组小鼠脑组织中的表达 ,并用同位素标记的Hox寡核苷酸探针进行Northernblot检测相应的表达状况。结果　 (1)接种HCMVAD16 9株的小鼠脑组织发生了病理改变 ,免疫组化和PCR方法在神经细胞内查到了HCMV LA和DNA ;(2 )RT PCR和Northernblot发现 :对照组的小鼠脑组织表达Hoxa2、Hoxb1和Hoxb2 ,但不表达Hoxb5、Hoxb8;HCMV感染后 ,小鼠脑组织被诱导表达Hoxa1,与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 .0 1) ,且于感染后的 15d达到高峰 ,而Hoxb1的表达下调 (P <0 .0 5 ) ;Hoxa2和Hoxb2无明显变化 ;Hoxb5和Hoxb8仍旧不表达。结论　HCMVAD16 9株可感染小鼠神经系统。HCMV感染可诱导小鼠神经系统发育基因Hox基因表达改变 ,这对     

特异性shRNA对小鼠海马神经干细胞中Olig2基因表达的影响

目的:构建RNA干扰(RNAi)少突胶质细胞转录因子2(Olig2)基因的小鼠海马神经干细胞(NSCs)体系,用于离体水平研究Olig2对精神分裂症模型海马神经发生的调控作用。方法:海马NSCs原代培养及鉴定;通过荧光显微镜分别观察24、48、72 h后NSCs感染情况,确定慢病毒感染的最佳时间;通过Western Blot筛选有效干扰Olig2的shRNA序列;在NSCs体系中加入浓度为200μmol/L的MK-801 24 h后,加入有效干扰Olig2的shRNA,通过Western Blot检测慢病毒感染后的Olig2蛋白表达。结果:慢病毒感染72 h后,海马神经干细胞球荧光表达最强,可达90%; Western Blot结果显示:与对照组比较,Olig2 shRNA3干扰组Olig2的蛋白表达明显降低(P 0. 05);干扰组可明显降低MK-801处理后的NSCs中Olig2蛋白表达(P 0. 05)。结论:成功构建RNA干扰Olig2基因的海马NSCs体系,为进一步研究Olig2对精神分裂症后海马神经发生的调控机制奠定了基础。     

HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。     

应用载体介导的RNA干扰技术抑制Nurr1基因在PT67细胞中的表达

本研究应用载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异地干扰孤儿核受体1(nuclear related factor1,Nurr1)基因的表达,以建立稳定的RNAi技术及用于下一步的Nurr1基因治疗研究。我们筛选了四对Nurr1基因的特异性序列shRNA(short hairpin RNA),构建相应的载体(psilencerTM3.1-H1neo shRNA1,2,3,4)。分别将这4种质粒瞬时转染入已转染了逆转录病毒质粒pLNCX2-Nurr1并稳定表达Nurr1基因的PT67细胞中。在转染后24、48和72h分别采用免疫荧光、免疫组化、免疫印迹以及Real-time PCR的方法检测细胞中Nurrl蛋白及基因的表达水平。结果显示,转染psilencerTM3.1-H1neo shRNA2、3号24h和48h后,经免疫荧光和免疫组化检测,Nurr1在PT67细胞中表达显著降低;免疫印迹结果也显示,Nurr1蛋白量明显低于阴性对照组。psilencerTM3.1-H1neo shRNA1、4对Nurr1蛋白表达没有明显影响。Real-time PCR相对定量结果也同样证实2、3号转染后Nurr1基因表达的干扰效果明显,而1、4号结果相对较弱。通过本实验,我们筛选出了两段Nurr1特异性siRNA序列,且干扰效果在转染后24h至48h时效果最为明显。     

敲低MSX2抑制小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达及牙釉质形成

目的研究肌节同源结构域同源框基因2(MSX2)对小鼠成釉细胞釉基质蛋白的表达及牙釉质形成的影响。方法免疫化学染色检测出生后小鼠牙胚MSX2的表达情况及其在成釉细胞中的定位;设计并合成靶向小鼠MSX2基因的短发夹RNA(shRNA)寡聚单链DNA,将退火成双链的DNA构建到RNAi慢病毒载体pG MLV-SC5中,包装慢病毒;慢病毒感染成釉细胞,实时荧光定量PCR筛选最佳干扰片段,并检测釉原蛋白(Amelx)、成釉蛋白(Ambn)、釉蛋白(Enam)、釉成熟蛋白(Amtn)及激肽释放酶4(Klk4)在mRNA水平表达的改变。通过分离小鼠E18.5牙胚并感染靶向MSX2的RNAi重组慢病毒,种植于小鼠肾囊膜下,10周后,取出组织,分离并观察牙齿结构。结果 MSX2在小鼠成釉细胞分泌期及成熟期均有表达,但分泌期表达信号较弱,成熟期较强。成功包装靶向MSX2基因的RNAi慢病毒MSX2-shRNA,敲低MSX2基因表达可不同程度地降低成釉细胞Amelx及Klk4的mRNA水平。靶向MSX2基因的RNAi慢病毒感染牙胚后其牙釉质矿化程度降低。结论 MSX2基因在小鼠成釉细胞中表达,敲低成釉细胞MSX2并促进釉基质蛋白基因的表达和牙釉质的矿化。     

HCMV编码的dsRNA结合蛋白在抗机体RNA干扰中的作用

人巨细胞病毒(HCMV)是一种感染广泛的疱疹病毒家族中的一员,它对人群中的易感者尤其对免疫能力下降患者的危害已引起社会的广泛重视.RNA干扰(RNAi)是近年来发现存在于体内抵御病毒感染和基因损伤的一种重要的保护机制.而HCMV则可通过编码dsRNA结合蛋白(DRBPs),特异性结合dsRNA,阻断宿主细胞抗病毒的RNAi途径,保护病毒mRNA的表达,最终达到逃避宿主细胞的抑制病毒转录的作用.     

RNA干扰技术在肿瘤研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的与其同源的mRNA特异性降解,导致转录后基因沉默。RNAi技术比传统的反义寡核苷酸技术更加有效,为在体内、外研究基因的功能提供了快速而相对简便的途径,并可能成为治疗肿瘤等疾病的有效手段。RNAi技术可以通过各种策略直接靶向肿瘤治疗。RNAi可以抑制癌基因、生长因子及其受体的过表达而抑制细胞生长;通过干扰细胞周期蛋白及其相关基因的表达可以抑制细胞增殖;靶向耐药基因的RNAi有利于肿瘤治疗。     

Efficient inhibition of human cytomegalovirus UL122 gene expression in cell by small interfering RNAs

In order to develop a gene therapy to human cytomegalovirus (HCMV), RNA interference (RNAi) was employed to inhibit the expression of HCMV UL122 gene in vitro. Recombinant vector pUL122‐EGFP, which expressed UL122‐EGFP fusion protein, and recombinant vectors psi122‐1, psi122‐2 and psi122‐3, which expressed small interfering RNAs (siRNAs) targeted to UL122 were contransfected into AD293 cells. The fluorescence signal of pUL122‐EGFP was greatly suppressed by psi122‐1 and psi122‐2, with an inhibitory rate of 82.0% ± 1.0% and 79.5% ± 2.5%, respectively. The mRNA of pUL122‐EGFP of the cells transfected with psi122‐1 and psi122‐2 was decreased 97.3% ± 0.6% and 98.0% ± 0.1%, respectively. Vector psi122‐3 showed a slightly low suppression rate. Therefore, it may be concluded that plasmids encoding siRNAs targeted to UL122 is able to in vitro reduce markedly the expression of UL122‐EGFP. And it is very likely that the psi122‐1 and psi122‐2 are potentially efficacious siRNAs in the gene therapy of HCMV infection in vivo, in which further investigations are required. This study is expected to greatly facilitate the use of the RNAi technology for the anti‐HCMV studies. (© 2009 WILEY‐VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim)     

人巨细胞病毒感染对小鼠脑组织同源盒基因表达的影响

目的研究小鼠脑组织同源盒基因（homeobox gene，Hox）的表达状态及人类巨细胞病毒（human cytomegalovims，HCMV）感染对小鼠脑组织Hox基因表达的影响，以探讨HCMV致畸的分子机制。方法昆明系小鼠48只，随机分为实验对照组（16只）和病毒感染组（32只），病毒感染为脑内注射。在感染后7、15、30、60d分别以病理学方法观察病理损伤，以免疫组化方法检查HCMV—LA（1ateantigen），PCR检测小鼠脑组织中HCMV—DNA。在建立HCMV脑部感染的小鼠模型基础上，用RT-PCR测定Hox基因在病毒感染组和实验对照组小鼠脑组织中的表达,并用同位素标记的cDNA探针进行Northern-blot检测相应的表达状况。结果（1）接种HCMVAD169株的小鼠脑组织发生了病理改变，免疫组化和PCR方法在神经细胞内查到了HCMV-LA和DNA；（2）RT-PCR和Northern-blot发现：对照组的小鼠脑组织表达Hox-A9、Hox-A11、Hox-A12和Hox-A13，但不表达Hox-B13；HCMV感染后，小鼠脑组织被诱导表达Hox-B13，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01），且于感染后的30d达到高峰，而Hox—A9、Hox—A11的表达下调（P〈0.05）；Hox—A10和Hox—A13的表达增强。结论HCMVAD169株可感染小鼠神经系统。HCMV感染可诱导小鼠神经系统发育基因Hox表达改变，这对研究HCMV感染致畸的分子机制提供了有价值的理论依据。     

5'-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷标记人巨细胞病毒感染SD大鼠脑组织神经元模型的建立

目的 用5'-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的人巨细胞病毒(HCMV)进行脑内定位注射,建立SD大鼠脑组织感染模型;研究大鼠脑组织海马部位神经元对HCMV的容许性及HCMV在其内的感染特点. 方法 运用BrdU标记HCMV基因组,并测定病毒滴度.将21只SD大鼠随机分为病毒感染组(n=18)及对照组(n=3),病毒感染组根据感染时间分为感染24、48及96 h组.每个感染时间组再分为2μl及4μl两个剂量组,每个剂量组包括3只动物,均以脑内注射途径将BrdU标记的HCMV直接注入大脑海马部位;对照组大鼠注射不含病毒的细胞培养上清液(4μl).感染大鼠术后分笼饲养,于各感染时间点处理大鼠取脑组织,冰冻切片;对海马周围部位脑组织分别运用抗BrdU及抗微管相关蛋白2(MAP-2)抗体进行免疫荧光双标染色检测标记病毒;抗pp65抗体免疫组化染色及Nissil复染检测病毒蛋白pp65. 结果 病毒感染后24 h,两个剂量组均未在神经元内检测到标记病毒及pp65.病毒感染后48h和96 h,两个剂量组在海马部位神经元中均检测到了标记病毒阳性荧光及pp65的阳性着色;而且2μl组的受感染神经元细胞数较4μl组少,但同-剂量组在镐h和96 h受感染神经元细胞数未见明显变化. 结论 成功建立了BrdU标记HCNV感染SD大鼠脑组织的模型.大鼠脑组织海马部位神经元是HCMV的半容许细胞,HCMV在其内仅表现为潜伏性感染.     

Cytomegalovirus prophylaxis with valganciclovir in cytomegalovirus-seropositive kidney-transplant patients

The aims of this prospective, open-label, single-center pilot study were to assess the efficacy and safety of human cytomegalovirus (HCMV) prophylaxis using valganciclovir in HCMV- seropositive kidney-transplant patients to prevent HCMV infection and disease. Fifty-one HCMV seropositive kidney-transplant patients recipients who received transplants between 1 December 2005 and 30 November 2006 were included in the study. Valganciclovir was given from transplantation up to 114 (37-329) days, and was adapted to renal function, i.e., 900 mg/d if calculated creatinine clearance was >60 ml/min, or 450 mg/day if it was <60 ml/min. HCMV DNAemia was assessed every 2 weeks during prophylaxis, and on the same basis for 3 months post-prophylaxis. Immunosuppression was based on calcineurin inhibitors (ciclosporine A=22; tacrolimus=11), with mycophenolate mofetil (n=51), and low-dose steroids. Eighteen patients received no calcineurin-inhibitors, but Belatacept instead. During valganciclovir prophylaxis, asymptomatic HCMV DNAemia was observed in one patient, and no case of HCMV disease occurred. Within 252 days (45-425) post-valganciclovir prophylaxis, HCMV DNAemia was detected in 23.5% (n=12) of patients, of whom two had two or more consecutive HCMV DNAemias. Valganciclovir prophylaxis in HCMV-seropositive kidney-transplant patients is effective for preventing cytomegalovirus disease.     

Lack of association between the kinetics of human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein B (gB)-specific and neutralizing serum antibodies and development or recovery from HCMV active infection in patients undergoing allogeneic stem cell transplant

The kinetics of the gB-specific and neutralizing antibody responses to human cytomegalovirus (HCMV) were analyzed in 26 allogeneic stem-cell transplant recipients who either did (n = 20) or did not (n = 6) develop asymptomatic HCMV active infection during the study period. Antibody response profiles varied widely among individuals in both groups, irrespective of whether HCMV active infection did or did not occur. Development of HCMV active infection was not preceded by a decline in functional serum antibody levels. Neither the absence nor the presence of HCMV active infection correlated with either high or low serum levels of gB-specific and neutralizing antibodies, respectively. In most patients, episodes of HCMV replication were not followed by a marked increment in functional serum antibody titers. Therefore, resolution of an ongoing HCMV active infection was not associated with a vigorous antibody response to viral replication. In addition, this study supports previous data indicating that passive transfer of human immunoglobulins may result in an increment in gB-specific and neutralizing serum antibody levels, the magnitude of which varies among recipients; however, both patients with and without measurable increments in serum antibody levels developed HCMV active infections with comparable frequency.     

颅内动脉粥样硬化血管壁中人巨细胞病毒即刻早期基因的表达

目的 通过检测颅内动脉血管壁中人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期(IE)基因的表达。研究HCMV感染与动脉粥样硬化的相关性。方法 选取35份有动脉粥样硬化的死亡病例颅内动脉和20份死亡病例的正常颅内动脉，分别应用原位杂交和PCR方法检测动脉管壁中HCMVIE基因DNA。结果 两种方法均发现动脉粥样硬化组HCMVIE基因检出率较正常对照组高，二者相比差异有显著意义(P=0．018，P=0．032)，而且Ⅲ-Ⅳ级动脉粥样硬化的检出率高于Ⅰ～Ⅱ级动脉粥样硬化(P=0．027，P=0．009)。结论 颅内动脉粥样硬化的血管壁中有HCMV存在，因此推测HCMV感染与颅内动脉粥样硬化的病理过程及病变程度有关。HCMV IE基因的表达可能是血管组织病变的早期曲蛮．