DCs疫苗的制备及动物抑制实验研究

目的：为研究疫苗在肿瘤防治领域的应用。方法：选择了以MCA38肿瘤细胞作为体外冲击树状突细胞的肿瘤抗原来源，以C57BL／6（H－2^6)近交系小鼠为实验动物制备树状突细胞疫苗并建立动物实验。结果：树状突细胞疫苗接种组瘤重与对照组相比明显减小（P＜0．05），60d无肿瘤生长率明显高于对照组（P＜0．05）。结论：树状突细胞疫苗可有效抑制肿瘤的发生与生长。     

见证SARS疫苗动物实验

引子：一种不为人所知的冠状病毒。曾让整个中乃至全世界都陷入惶恐。事实上，就在SARS病毒幽般地在中国大地上游荡时。大批科学家和技术人员就入了SARS疫苗的研制工作。2003年11月23日。国家食品药品监督管理局官对外宣布：SARS病毒灭活疫苗已在动物身上实验成功。最先传出佳音的是北京科兴生物制品有限公司。他们与中国医学科学院动物研究所。以及中国疾病预防控制中心病毒所共同完成了SARS疫苗的临床前研究。2003年11月28日。又一批成功通过动物实验的SARS疫苗针剂。悄悄进入国家食品药品监督管理局的“快速审批通道”。与科兴公司不同。前者是国家“防治非典指挥部科技攻关组”正式批准的两支“国家队”之一。而此次的送审者为一家社团组织一——中国医学基金会新药发展基金管委会。这家基金会自筹资金完成了SARS灭活疫苗的前期研制。而且他们委托了目前国内规模最大的武汉大学生物安全三级动物实验室(即P3动物实验室)。同时做了18只猴子的对比实验。更有力地证实了疫苗的安全性和保护性。这是国内迄今为止规模最大的一次SARS疫苗动物实验。社会力量正悄然推动着科技进步。     

DNA疫苗动物实验的研究进展

疫苗是减少或防止传染病带来的病痛和损失的最为有效的方法之一 ,而且也逐渐向治疗领域延伸 ,如美国最近研制的针对繁殖细胞的单疱 6携带DNA的治疗性疫苗。虽然我们在对许多传染病疫苗的发展中取得了较大进展 ,但仍存在没有有效疫苗的疾病 ,这也就是第三代疫苗发展的重点原因。DNA疫苗是通过基因重组技术使编码能引起保护性免疫反应 ,得到病原体抗原基因和载体 (质粒和病毒或细菌 ) ,直接注入体内 ,目的基因在体内表达出抗原蛋白经MHCI类或MHCII类分子提呈 ,诱导抗体的表达及细胞依赖的细胞裂解等一系列特异性免疫应答。它之所以有很…     

SOCS1 受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞(BMDC),体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原,并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸(AS1)处理DC,制备负载肝癌抗原DC疫苗;流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度;通过体外细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下,疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高(P<0.01),能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力(P<0.01)。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度,并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

SOCS1受抑的新型肝癌树突状细胞疫苗制备及功效的初步研究

目的探讨抑制SOCS1表达对LIGHT激活的肝癌树突状细胞疫苗效应的作用。方法用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）体外诱导培养小鼠骨髓单核细胞产生骨髓来源树突状细胞（BMDC），体外负载肝癌细胞HepA可溶性抗原，并用LIGHT和SOCS1反义寡核苷酸（AS1）处理DC，制备负载肝癌抗原DC疫苗；流式细胞仪检测疫苗细胞CD40及CD86表达和ELISA测定其IL-12、IL-1分泌水平以确定DC疫苗细胞的成熟度；通过体外细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性、淋巴细胞增殖反应和IL-6、TNF-β分泌水平测定分析疫苗细胞的抗肿瘤免疫应答。结果负载肝癌抗原DC疫苗在LIGHT和AS1的双重作用下，疫苗细胞的成熟标志CD40、CD86、IL-1和IL-12增高（P〈0．01），能增强诱导CTL活性、刺激淋巴细胞增殖和分泌IL-6、TNF-β能力（P〈0．01）。结论抑制SOCS1能提高肝癌DC疫苗的成熟度，并增强疫苗细胞诱导抗肿瘤免疫应答。     

临床用的抗肿瘤树突状细胞疫苗的制备及保存

目的探讨在体外制备可供临床使用的肿瘤树突状细胞疫苗的有效途径及冻存方法.方法采用外周血单核细胞诱导DCs,自体胃癌细胞裂解抗原负载DCs,制备树突细胞疫苗.分别观察、检测了新鲜制备的DCs疫苗和冻存2周及2月的DCs疫苗的大体形态,免疫表型及刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力,并行细菌学检查.结果新鲜制备的DCs疫苗高表达成熟DCs表面标志物HLA-DR、CD80及CD83,具有很强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力.疫苗冻存2个月以内,DCs细胞表型及刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力无明显下降.结论采用本方法制备的DCs疫苗,无论从数量及质量均达到了临床应用的要求.并且证实疫苗冻存2月以内对疫苗质量无明显影响.     

HBsAg冲击的树突状细胞疫苗的制备及免疫活性研究

目的:探讨利用HBsAg冲击树突状细胞（Dendriticcells,DC）制备HBsAg-树突状细胞疫苗（HBsAg-DC疫苗）的基本方法并检测其免疫活性。方法:收集Lewis大鼠骨髓细胞,加入含rGM-CSF（4ng/ml）及rIL-4（8ng/ml）的RPMI1640培养7d后,加入HBSAg（100μg/ml）再培育48h,即获得HBsAg-DC疫苗。倒置显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测其表型;单向混合淋巴细胞反应评价HBsAg-DC疫苗的细胞免疫活性。结果:采用该方法可诱导扩增出较多数量和较高纯度DCs。HBsAg冲击DCs后,明显增强DCs的T细胞刺激活性。同种异体和自体之间T淋巴细胞增殖功能没有显著差异（P>0.05）。经HBsAg冲击后第3d（培养第10d）的DCs在异体T淋巴细胞增殖反应中能够诱导出很强的增殖应答反应;MTT比色法分析显示不同密度的DCs和HBsAg-DCs经丝裂霉素C处理后,均能明显刺激同种异体T细胞增殖,且该效应随着DCs和HBsAg-DCs数量的增加而逐渐增强（P<0.01）;同密度的HBsAg-DCs比DCs的刺激作用更强,差异有显著性（P<0.01）。结论:本方法可以诱导扩增出较多数量和较高纯度DC,HBsAg-DC具有较强的抗原递呈能力。     

树突状细胞-结直肠癌细胞融合疫苗的制备及生物学特性的研究

目的：研究树突状细胞（DC）与结直肠癌（Lovo）细胞融合疫苗的制备及其生物学特性。方法：①应用PEG融合技术融合树突状细胞和Lovo细胞，制备融合疫苗。②通过描记细胞生长曲线、倒置显微镜和激光共聚焦显微镜、流式细胞仪检测观察细胞生物学特性。③通过检测疫苗的克隆形成率、促进T淋巴细胞增殖能力和疫苗的成瘤活性来观察疫苗的安全性和免疫学效应。结果：融合疫苗呈悬浮生长，具有两种亲代细胞的形态结构特点，CD80、CD83、CD86等在融合细胞表面的表达较单纯DC显著丰富；融合细胞不出现明显的细胞倍增；融合疫苗在软琼脂上培养21d，未见明显的细胞克隆形成；通过^3H—TdR掺人法检测融合细胞刺激T淋巴细胞增殖情况，发现融合疫苗可强烈刺激T淋巴细胞增殖；融合疫苗接种于裸鼠体内观察30d，未见肿瘤组织生长。结论：融合细胞具有作为抗肿瘤疫苗应具备的低增殖能力和不成瘤的安全性；融合疫苗可明显促进T淋巴细胞的增殖能力说明将其作为抗结直肠癌特异性免疫治疗方法有进一步研究的意义。     

DNA疫苗引发局部肌肉组织DCs、CD4+T细胞的聚集浸润

目的 观察在注射DNA疫苗后的不同时间段内,肌肉注射部位细胞的聚集情况,并对细胞表型进行检测,为阐述DNA疫苗激活机体免疫反应机制提供直接的组织学证据。方法 分别于DNA注射小鼠后6h、12h、1d、2d、3d、4d、5d、6d切取注射部位肌肉组织,HE染色观察细胞聚集情况;LSAB法检测聚集细胞CD205、CD4及CD8分子的表达。结果 疫苗注射后6h～6d,在肌肉组织间隙中发现有不同程度的细胞浸润,早期主要以巨噬细胞样细胞和淋巴细胞为主,晚期巨噬细胞样细胞占优势。在疫苗注射后24h的肌肉组织中有少量的CD205阳性细胞,第3d时数量稍多,其余时间段CD205染色均为阴性。对浸润的淋巴细胞的亚型进行鉴定发现,在6h～6d的肌肉切片中只检测到CD4^ T细胞,未发现CD8^ T细胞的细胞。结论 DNA疫苗免疫注射引发的细胞浸润与一般的炎症反应不同,有其特有的特征。DCs、CD4^ T细胞参与DNA免疫并可能起着重要的作用;DNA免疫激活的CTL发挥免疫效应可能不在肌肉组织。     

恶性疟BCG多价疫苗及DNA疫苗的实验研制

本项目在恶性疟疫苗候选分子裂殖子表面蛋白-2（MSA2）及环子孢子蛋白（CSP）的分子生物学特征和免疫原性研究的基础上,构建了CSP、MSA2之DNA疫苗,同时率先在国内外构建CSP、MSA2之重组BCG活疫苗,并对疫苗的免疫保护机制、免疫应答及疫苗     

肿瘤抗原脉冲致敏的树突状细胞疫苗抗肿瘤作用的实验研究

进一步研究体外肿瘤抗原脉冲致敏的骨髓树突状细胞瘤苗主动免疫诱导小鼠体内抗肿瘤免疫应答,并观察其抵抗野生性肿瘤攻南听免疫保护作用及对荷瘤小鼠模型的免疫应答。方法采用本室建立的骨髓树状细胞分离与细胞因子体外扩增培养方法,并在体外经灭活ＮＳ１骨髓瘤细胞及其裂解产物脉冲刺激后直接作为疫功苗。     

骨髓树突状细胞融合瘤苗抗肿瘤免疫预防与治疗的实验研究

进行研究树突状细胞与肿瘤细胞的融合瘤苗细胞主动免疫诱导体内抗肿瘤免疫反应及对荷瘤小鼠的免疫治疗效果。方法直接分离骨髓树突状细胞和体外生长因子诱导扩增培养相结合,获得大量高纯度的树突状细胞,再以５００ｇ／ＬＰＥＧ诱导其与ＮＳ１骨髓细胞融合,ＨＡＴ选择培养得到两者的融合细胞,体外进行混合淋巴细胞培养,并进行免疫预防与治疗的在体外动物实验。结果融合细胞也能诱导淋巴细胞增殖反应,而ＮＳ１无此作用。体内免疫     

腺病毒介导 HSV-2 gD 基因修饰的树突状细胞疫苗制备

目的：生殖器疱疹尚无彻底治愈的方法。研制有效的生殖器疱疹病毒疫苗是预防和治疗HSV-2感染的关键,文中探讨制备腺病毒介导的HSV-2 gD基因修饰的树突状细胞（ dendritic cell , DC）疫苗的可行性。方法将HSV-2 gD蛋白基因克隆到质粒载体Shuttle-2,重组质粒酶切鉴定、测序鉴定后构建重组腺病毒pAdeno-HSV-2 gD。分离小鼠骨髓DC细胞, pAdeno-HSV-2 gD转染DC细胞后用流式细胞术检测DC表型,用免疫组化法、RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot 方法检测HSV-2 gD的表达情况。结果以HSV-2病毒DNA为模板,采用gD基因引物扩增出相应的目的片段。琼脂糖凝胶电泳显示,PCR产物gD基因同预期的大小一致（1182 bp）。 pAdeno-gD DNA用脂质体法转染293细胞10 d,反复冻融获得pAdeno-HSV-2 gD重组腺病毒,活性为4×1010 IU／mL。流式细胞仪检测结果显示：成熟DC和腺病毒感染后DC,CD40含量为（74．2±3．9）％、（81．3±3．1）％,CD80含量为（73．9±4．1）％、（80．4±2．9）％,CD86含量为（76．1±5．5）％、（83．7±3．9）％,均较不成熟DC的CD40、CD80、CD86含量[（9．7±0．5）％、（7．5±1．2）％、（5．2±1．1）％]升高（P＜0．01）。 pAdeno-HSV-2 gD-DC和细胞因子刺激诱导成熟的DC细胞表面分子表达差异无统计学意义（P＞0．05）。 RT-PCR、免疫组织化学方法证明HSV-2 gD能在DC细胞内表达,表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析发现,在相对分子质量为43000处有外源蛋白表达,与预期蛋白条带一致。结论成功制备了pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗。     

高强度聚焦超声制备DC瘤苗及其对BALB/c小鼠肿瘤治疗作用的实验研究

目的用高强度聚焦超声(HIFU)制备肿瘤抗原致敏树突状细胞(DC),观察其对BALB/c小鼠肿瘤的治疗作用。方法用剂量为1000W/cm2×30 s的HIFU辐照体外培养的CT-26结肠癌细胞,获取肿瘤抗原,与体外培养扩增第5天的DC共孵育,制备DC瘤苗。正常BALB/c小鼠皮下接种活的CT-26结肠癌细胞,7天后分别经皮下注射HIFU辐照制备的DC瘤苗,一周后以相同剂量加强治疗。3周后处死老鼠,剥离肿瘤,测量肿瘤重量和肿瘤体积及祛瘤小鼠的净重,剩余观察小鼠的生存时间及生存率。并设立反复冻融法致敏DC组(冻融组),单纯的DC细胞组(单纯DC组),以及等量的无血清培养液组(阴性对照组),比较各组是否有差异。结果 HIFU组、冻融组与单纯DC组、阴性对照组比较3周时肿瘤重量、肿瘤体积、祛瘤小鼠净重、小鼠中位生存时间等差异均有显著性意义(P均<0.01或P均<0.05)。HIFU组与冻融组比较肿瘤重量、体积及小鼠中位生存时间差异亦有显著性意义(P<0.05)。结论 HIFU辐照法制备的DC瘤苗对小鼠肿瘤有一定的治疗作用,并优于反复冻融法制备的DC瘤苗。     

树突状细胞肺癌疫苗制备的实验研究

①目的 探讨具有较强免疫活性树突状细胞（DC）的制备及其鉴定。②方法 采用3M KCL提取法和弱酸洗脱法获得肺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，并定量抗原多肽浓度；用GLC-82细胞抗原多肽；中击致敏，从人外周血PBMC中用GM—CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC-82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；③结果 人体外周血PBMC体外经7天诱导出的DC，具有典型的树突状细胞特性，经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，高表达CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋，且随培养时间延长，CD3^＋和CD8^＋ T 细胞百分率增加，CD4^＋／CD8^＋比例下降，动态观察CTL增殖倍数迅速增加；④结论 利用3Mkcl单盐提取法制备肿瘤可溶性抗原，并以终浓度50ng,／mL冲击致敏，从外周血PBMC中分离、扩增、活化的DC，使其负载肿瘤抗原，体外诱导能产生特异性CTL。     

T细胞疫苗诱导同种抗原特异性免疫耐受的实验研究

目的　探讨T细胞疫苗诱导同种异体免疫耐受的作用及其机制。方法　制备BN大鼠针对Lou/C大鼠 (同种异体抗原 )的T细胞疫苗 (LCTCV)及针对Lewis大鼠 (同种无关抗原 )的T细胞疫苗 (LTCV) ,然后分别免疫正常BN大鼠 ,连续 3周 ,每周 1次 ,同时设空白对照。以被免疫BN大鼠的脾细胞作为反应细胞 ,以Lou/C大鼠的脾细胞作为刺激细胞 (经丝裂霉素处理 ) ,于接种前和每次接种后第 5天进行单向混合淋巴细胞反应 (MLR) ,同时对外周血T细胞凋亡和T细胞亚群CD4+ 、CD8+ 进行检测。结果　MLR结果显示 ,在LCTCV组 ,BN大鼠的脾细胞反应程度比接种前显著减弱 (P <0 .0 1) ,组间相同时点比较 ,　LCTCV组每分钟脉冲数值 (cpm值 )显著低于其他两组 (P <0 .0 1) ,在LTCV组 ,BN大鼠脾细胞的反应性显著高于LCTCV组 (P <0 0 1) ,而低于空白对照组 (P <0 0 5 ) ;在LCTCV组和LTCV组 ,外周血T细胞凋亡率于接种后显著增加 (P <0 0 1) ,并随着接种次数的增加而升高 ;CD4/CD8于接种TCV后明显减小 ,并且与cpm值的递减趋势一致。结论　T细胞疫苗可以诱导出同种异体特异性免疫耐受。通过诱导抗原反应性T细胞凋亡去除独特型T细胞克隆 ;可能在T细胞疫苗诱导特异性免疫耐受中起着关键性作用 ,CD4/CD8在一定程度上反映机体免疫耐受状态 ,CD8+     

负载前列腺干细胞抗原的树突状细胞疫苗制备

目的研究在体外负载前列腺干细胞抗原(PSCA)制备树突状细胞(DC)疫苗的方法。方法应用PSCA融合蛋白冲击致敏由外周血单个核细胞分离培养得到的人DC,采用流式细胞仪检测其活化前、后的表型变化,混合淋巴细胞反应检测其在体外刺激淋巴细胞增殖的能力。结果DC-PSCA组白细胞介素(IL)-12(p40)和IL-1β浓度分别为(183.0±5.0)和(1183.0±30.9)ng/L,显著高于DC-TRX组[(162.0±2.5)和(971.0±10.4)ng/L,P值均<0.01]和DC组[(30.0±2.6)和(204.0±6.1)ng/L,P值均<0.01]。不同抗原冲击活化后,DC-PSCA组人类白细胞抗原(HLA)-DR、CD80、CD86、CD40的荧光强度(除去同型对照抗体荧光强度后的数值)分别为101.7±9.8、334.2±18.3、371.2±22.5和102.3±8.2,显著高于DC-TRX组(88.4±6.3、304.3±19.4、315.5±24.7和94.6±7.9,P值均<0.05)和DC组(68.8±3.0、283.2±23.1、265.4±18.8和77.2±4.6,P值均<0.05)。经肿瘤坏死因子-α活化后的DC-PSCA组放射性活度值(cpm值)显著高于其他两组(P值均<0.05)。结论PSCA融合蛋白体外冲击DC是一种制备DC疫苗的有效方法。     

mRNA疫苗冲击树突状细胞诱导抗肿瘤免疫反应的研究

目的：以消化道肿瘤组织mRNA冲击自体DC，诱导特异性免疫应答。方法：20例消化道肿瘤患者外周血分离PBMC(外周血单核细胞)，在IL-4、GM-CSF联合作用下诱导DC，从消化道肿瘤组织中提取mRNA并分别在有脂质体或无脂质体介导下冲击DC，与未经纯化的T细胞混合培养，诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)。以CTL作为效应细胞，以胃癌细胞系803为靶细胞，LDH释放实验检测杀伤活性。结果：细胞表面标记检测显示诱导前后CD3、CD4、CD14显著下降，CD40、CD86、CD1a、CD83、HLA-DR显著升高，表明IL-4、GM-CSF、联合作用下有效诱导出DC，混合淋巴细胞增殖实验表明该DC具有抗原递呈，刺激淋巴细胞增殖的功能。经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应与未经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应比较，其杀伤率经统计学分析无显著性差异。而二者与单纯经IL-2诱导的未经纯化的T细胞产生的非特异性杀伤比较均有显著性差异。结论：以肿瘤细胞mRNA冲击DC诱导CTL可有效杀伤肿瘤细胞，有可能成为一独特的免疫治疗方法。     

DCs和CIK细胞的研究进展

近几年,随着肿瘤的过继免疫治疗的新近发展,DCs和CIK细胞治疗恶性肿瘤逐渐成为国内外关注的焦点。自上世纪80年代发现这种细胞起,人们对于DCs、CIK细胞生物学特征的认识一直在不断的更新,目前以DCs和CIK细胞为主的治疗恶性肿瘤的技术已经在国内临床开展,并有望成为肿瘤综合治疗研究的新方向。     

脑损伤诱导神经细胞凋亡的动物实验研究

为探讨脑损伤诱导神经细胞凋亡的作用及其机制,应用大鼠液压冲击脑损伤模型,在脑损伤后不同时间段（３ｈ,１２ｈ,２４ｈ,４８ｈ,７２ｈ）处死动物,分别应用ＨＥ染色、流式细胞仪检测、ＴＵＮＥＬ法测定、ＤＮＡ凝胶电泳分析,免疫组化研究神经细胞凋亡的改变。结果显示：动物经中度脑损伤处理后,其受伤各时间段脑组织可见凋亡的神经细胞及ＴＵＮＥＬ阳性细胞,ＤＮＡ呈现“梯状”断裂现象,细胞凋亡百分率为９．８％￣１４．