Toll样受体4与胰腺癌的关系

Toll样受体4(TLR4)是固有和适应性免疫反应的关键调节因子。TLR4在胰腺疾病方面的作用是近年的研究热点,已经有大量研究证明了TLR4与胰腺癌密切相关。主要探讨了TLR4在胰腺癌中的异常表达、调控机制,及其治疗癌症方面的潜力,以期为认识胰腺癌的发病机制和治疗提供新的启示。     

Toll样受体4在冠状动脉粥样斑块中的表达及其与冠心病猝死的关系

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)在冠状动脉粥样硬化斑块中的表达及其与冠心病猝死的关系.方法 从本教研室2003-2006年尸检档案中挑选病例及心脏标本、蜡块共75例.分为冠心病猝死组(28例)、冠心病非猝死组(简称冠心病组,28例)和对照组(无明显冠状动脉粥样硬化者,19例).用免疫组化SABC法、图像分析技术和SPSS14.0统计学软件检测TLR4在不同组的冠状动脉粥样硬化斑块内表达的阳性细胞面积/扫描面积(R)和平均光密度值(A)及各组间的差异.结果 猝死组中13例(46.4%)TLR4蛋白强阳性表达,11例(39.3%)为较强阳性表达,4例(14.3%)为较弱阳性表达.冠心病组中8例(28.6%)呈较弱的阳性表达,17例(60.7%)很微弱的阳性表达,3例(10.7%)未见阳性表达.对照组冠状动脉内膜及轻度增厚处呈阴性表达.猝死组冠状动脉粥样硬化斑块中TLR4表达的A值(1.140±0.101)和R值(0.0269±0.0027)均高于冠心病组(A值:0.719±0.205,R值:0.0085±0.0007;均P＜0.01)和对照组(A值:0.481 ±0.033,R值:0.0046±0.0004;均P＜0.01).冠心病组的A值也高于对照组(P＜0.05),而R值差异无统计学意义.结论 冠状动脉粥样硬化斑块中TLR4表达情况可作为冠心病猝死者病理诊断的一个重要指标,也可为临床防治冠心病和急性冠状动脉综合征提供一个新的思路.     

DLL4在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系

目的 检测delta-like ligand 4(DLL4)在胰腺癌中的表达,分析其与肿瘤血管生成及临床病理特征的关系.方法 采用免疫组化SP法检测60例胰腺癌组织及20例癌旁正常胰腺组织中DLL4的表达;观察微血管内皮细胞CD34表达,计算微血管密度(MVD);分析DLL4表达、MVD与胰腺癌临床病理特征之间的关系以及两者的相关性.结果 DLL4在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织(68.3％比20.0％,P＜0.01);胰腺癌组织DLL4的高表达与肿瘤分化程度、TNM分型、肿瘤转移及浸润等呈正相关(P值均＜0.05),而与肿瘤部位、大小、组织病理分型无关.胰腺癌组织MVD明显高于正常胰腺组织(34.9±13.2比18.9±2.2,P＜0.01);胰腺癌的MVD与肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤转移及浸润有关(P值均＜0.05),而与肿瘤部位、大小、组织病理分型等无明显相关性.DLL4表达阳性的胰腺癌组织MVD明显高于DLL4表达阴性者(38.8±10.7比29.0±15.2,P＜0.05),且DLL4表达与MVD呈显著正相关(r=0.669,P＜0.05).结论 DLL4表达可促进肿瘤血管生成,且与胰腺癌的转移、浸润相关.     

Toll样受体9在胰腺癌组织中的表达及临床意义

目的 检测Toll样受体9(TLR9)在胰腺癌组织中的表达,探讨其临床意义.方法 采用实时定量PCR法、蛋白质印迹法及免疫组化法检测30例胰腺癌及其相应癌旁组织、10例正常胰腺组织中TLR9的表达,分析胰腺癌组织TLR9表达与临床病理参数的关系.结果 以正常胰腺组织作为对照,胰腺癌组织TLR9 mRNA表达倍数为2.32(1.41～3.22),癌旁组织为1.23(1.18～1.28),两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).胰腺癌组织TLR9蛋白阳性表达率为73.3%(22/30),癌旁组织为33.3%(10/30),正常胰腺组织为20.0%(2/10),三者的TLR9相对表达量分别为0.780±0.026、0.400±0.018、0.173±0.043,三组间比较差异有统计学意义(P值均＜0.01).胰腺癌组织TLR9高表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移呈正相关.结论 胰腺癌组织高表达TLR9,它可能参与胰腺癌的恶性转化过程.     

Toll样受体4及Tollip蛋白在大肠癌中的表达及临床意义

目的探讨Toll样受体4（TLR4）及Tollip蛋白在大肠癌发生、发展过程中的作用。方法采用免疫组化SP法检测TLR4和Tollip蛋白在51例大肠癌癌组织和20例癌旁正常组织中的表达,并分析两者与大肠癌临床分期、病理分级的相关性。结果TLR4及Tollip蛋白在大肠癌组织中的表达显著强于癌旁正常组织,且两者表达随肿瘤临床病理分期进展及病理分级降低而升高（P〈0．01）。结论TLR4、Tollip蛋白在大肠癌发生、发展过程中发挥一定免疫作用,可作为判断大肠癌进展程度的参考指标。     

Toll样受体4与肝损伤

Toll样受体是近几年发现的天然免疫受体，主要参与病原微生物产物的识别及炎症信号传导，是天然免疫与获得性免疫的连接点。Toll样受体4介导内毒素引起的感染性免疫反应，参与了肝脏内的损伤、纤维化、再生与修复等炎症反应过程。     

Toll样受体4与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病。Toll样受体家族(TLRs)识别抗原相关的分子模式(PAMPs)后激发先天性免疫反应。TLR4不仅识别外源性配体脂多糖(LPS),也识别动脉损伤过程中表达的内源性配体。越来越多的研究表明TLR4可能在动脉粥样硬化病变的发生和发展过程中发挥主要作用。现对近年有关TLR4在动脉粥样硬化中的作用的研究进展作一综述。此外,还将讨论对TLR4信号的可能干预措施。     

TMPRSS4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的 检测Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4( TMPRSS4)在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系.方法 采用实时PCR法和蛋白质印迹法检测16例胰腺癌和配对癌旁组织TMPRSS4 mRNA和蛋白表达;采用免疫组织化学法检测61例胰腺癌标本、26例配对癌旁组织、4例正常胰腺组织TMPRSS4蛋白的表达,分析其与临床病理特征的相关性.结果 胰腺癌组织TMPRSS4mRNA和蛋白表达明显高于配对癌旁组织(9.09±7.01比1.27±0.72;1.223±0.125比0.667 ±0.106,P值均＜0.01),胰腺癌组织TMPRSS4蛋白阳性表达率为67.2％ (41/61),显著高于癌旁组织3.8％ (1/26)的阳性表达率(P＜0.01).正常胰腺组织未见TMPRSS4蛋白表达.胰腺癌TMPRSS4表达与患者年龄、性别及肿瘤部位、肿瘤大小无关,而与肿瘤分化程度、淋巴结转移、临床分期密切相关(P值均＜0.05).结论 胰腺癌组织高表达TMPRSS4,其表达与肿瘤的恶性程度相关.     

慢性乙型肝炎与Toll样受体2的关系

目的探讨CHB与Toll样受体2（TLR2）的相关性。方法采用Elivision二步法检测CHB、慢性重型肝炎患者及健康对照组肝组织TLR2的表达。采用直接免疫荧光流式细胞术检测TLR2在肝癌细胞株HepG2、HepG2-X及HepG2．2．15上表达的平均荧光强度（MFI）及阳性细胞率。结果TLR2在CHB及慢性重型肝炎肝组织上的表达明显高于健康对照组，差异有统计学意义，P〈0．01，主要表达于肝细胞质及部分胞膜。在CHB中，TLR2的表达强度与肝组织炎症活动度分级（G）呈显著正相关（r=0．597，P〈0．01），各级炎症患者肝组织TLR2阳性表达强度患者的血清TBil值，差异有统计学意义（P〈0．05）。在慢性乙型重型肝炎患者中，TLR2主要呈小灶性表达。TLR2在肝癌细胞株HepG2．2．15上表达的平均荧光强度为10．7±2．8，阳性细胞率为16．3％±7．0％；HepG2的平均荧光强度为1．0±0．3，阳性细胞率为0．4％±0．1％，两组比较t值分别为11．92和7．92，P值均〈0．0l。而HepG2和HepG2-X之间，差异无统计学意义。结论CHB患者肝组织中TLR2的表达明显升高，与肝组织的炎症活动密切相关。     

维生素K_2对大鼠血管平滑肌细胞钙化及Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨维生素K_2对血管平滑肌细胞(VSMC)钙化及Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的影响。方法体外培养A7r5VSMC分为正常组(基础培养液),钙化组(加入10mmol/Lβ磷酸甘油),干预组(钙化基础上加入维生素K_210-6 mmol/L),各组均干预14d。Von Kossa染色观察VSMC钙化发生情况;检测细胞钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性;实时定量PCR及Western blot检测TLR2和TLR4mRNA和蛋白表达水平。结果钙化组细胞钙含量及ALP活性较正常组分别增加11.5倍和9.3倍(P<0.01);干预组细胞钙含量及ALP活性较钙化组分别减少1.5倍和2.3倍(P<0.01)。与正常组比较,钙化组细胞TLR2、TLR4蛋白及mRNA表达升高;与钙化组比较,干预组细胞TLR2、TLR4蛋白及mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论维生素K_2抑制细胞钙化的作用可能与TLR2和TLR4表达的下调有关。     

缺氧诱导因子-1α表达与胰腺癌病理学特征及新生血管生成的关系

目的　研究胰腺癌组织中缺氧诱导因子 - 1α(HIF- 1α)的表达与胰腺癌病理学特征的关系 ,以及 HIF- 1α表达与血管内皮生长因子 (VEGF)和肿瘤微血管密度 (MVD)之间的相互关系。方法　应用免疫组织化学方法检测 4 7例胰腺癌和 10例正常胰腺组织中 HIF- 1α和 VEGF蛋白的表达。同时用CD34单克隆抗体标记胰腺癌和正常胰腺组织中的微血管。结果　 HIF- 1α和 VEGF蛋白在 4 7例胰腺癌组织中的阳性表达率分别为 5 5 .3% (2 6 / 4 7)和 6 1.7% (2 9/ 4 7) ,而在 10例正常胰腺组织中均未见表达。胰腺癌组织 MVD为 37.6 1± 14 .3,正常胰腺组织为 7.5 5 ± 2 .4 ,二者间有显著性差别 (t'=13.5 1,P<0 .0 0 1)。 HIF- 1α和 VEGF蛋白阳性表达率及 MVD均与胰腺癌的浸润和转移密切相关 (χ2 =4 .32 ,6 .0 1,4 .75 ,4 .6 2 ;t=2 .38,3.92 ;P<0 .0 5 ) ,而与胰腺肿块大小、组织学分级和患者术后 1年生存率无关 (P>0 .0 5 )。HIF- 1α与 VEGF(r=0 .32 9,χ2 =5 .71;P<0 .0 5 )、HIF- 1α与 MVD(r=0 .5 94 ,t=4 .96 ;P<0 .0 0 1)及 VEGF与 MVD(r=0 .36 6 ,t=2 .6 4 ;P<0 .0 5 )间在胰腺癌组织中的表达均呈显著的正相关性。结论　在缺氧状态下 ,胰腺癌组织中 HTF- 1α基因被激活 ,过量表达 HIF- 1α蛋白 ,并通过诱导 VEGF     

组蛋白去乙酰化酶1在胰腺癌表达及临床意义

目的 探讨胰腺癌组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1,HDAC1)表达的临床意义.方法 收集30例胰腺癌和相应癌旁组织,应用实时定量PCR和免疫组织化学方法检测HDAC1的表达,并分析胰腺癌HDAC1表达与临床病理参数的关系.结果 胰腺癌HDAC1 mRNA表达指数为2.60(0.42～12.81),癌旁组织为1.02(0.19～3.58),两组表达有显著差异(P=0.001).胰腺癌HDAC1蛋白表达阳性细胞率为(56±26)%,癌旁组织为(6±6)%,相差显著(P=0.000).以阳性细胞率平均值56%为界,高表达(≥56%)18例,低表达(＜56%)12例.胰腺癌HDAC1高表达和肿瘤TNM分期、淋巴结转移相关.结论 胰腺癌HDAC1高表达提示肿瘤可能已属晚期,预后不良.     

Mucin4在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织中Mucin 4(MUC4)的表达及其与临床病理参数间的关系。方法(1)采用ABC免疫组织化学方法检测35例胰腺癌、12例胰腺良性肿瘤及5例慢性胰腺炎组织MUC4的表达。(2)通过RT-PCR方法检测12例胰腺癌组织、癌旁胰腺组织以及2株胰腺癌细胞株MUC4 mRNA的表达。结果 (1)35例胰腺癌组织中MUC4蛋白阳性表达24例,12例胰腺良性肿瘤中MUC4蛋白阳性表达2例,5例慢性胰腺炎组织中MUC4蛋白均为阴性。MUC4蛋白胰腺癌组织中阳性表达率显著高于胰腺良性肿瘤及慢性胰腺炎组织(P<0．05)。MUC4在胰腺癌组织中阳性表达率与肿瘤的部位、淋巴结转移、临床分期无关(P>0．05)。(2)12例胰腺癌组织中MUC4 mRNA表达阳性有6例,癌旁组织中无阳性表达,2株胰腺癌细胞株均呈阳性表达。MUC4 mRNA在胰腺癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0．05)。结论 MUC4在胰腺癌中有较高的表达率,检测其表达可能有助于胰腺癌的诊断,并可作为鉴别胰腺癌和慢性胰腺炎一个重要参考指标。     

雷公藤内酯醇对胰腺癌PANC1细胞Toll样受体4/核因子-kB信号通路的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇(TP)对人胰腺癌PANC1细胞株侵袭能力的影响及其与Toll样受体4/核因子-KB(TLR4/NF-KB)信号通路的关系.方法 将PANC1细胞分为亲本细胞组、TP组、脂多糖(LPS)组和TP+ LPS组.TP组培养液中加入50 ng/ml的TP,LPS组加入1μg/ml的LPS,TP+ LPS组先用50 ng/ml的TP处理2h,再加入1 μg/ml的LPS.各组细胞均常规培养24 h.采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测TLR4、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和蛋白的表达,双荧光素酶报告基因系统检测NF-KB活性,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 亲本组、LPS组、TP组、TP+ LPS组的TLR4mRNA表达量分别为0.41 ±0.06、0.46±0.10、0.20±0.04和0.25±0.06,TLR4蛋白表达量分别为0.55±0.06、0.60±0.03、0.18±0.04和0.13±0.00;NF-KB活性分别为13.0±3.0、31.6±4.3、7.3±1.5和10.8±2.1;穿膜细胞数分别为(56.8±8.6)、(104.5±12.8)、(32.0±5.7)和(46.8±7.0)个;MMP-9mRNA表达量分别为0.36±0.05、0.58 ±0.07、0.18±0.03和0.30±0.004,MMP-9蛋白表达量分别为0.31±0.04、0.53±0.08、0.11±0.02和0.15±0.00.LPS组TLR4 mRNA和蛋白表达量与亲本组差异无统计学意义,但NF-KB活性、穿膜细胞数、MMP-9 mRNA和蛋白表达量显著高于亲本组(t值分别为8.654、7.593、6.655、4.982,P值均＜0.01).TP组TLR4 mRNA和蛋白表达量、NF-KB活性、穿膜细胞数、MMP-9 mRNA和蛋白表达量均显著低于亲本组(t值分别为-7.609、-9.948、-4.176、-5.915、-8.179、-9.948,P值均＜0.01).TP+ LPS组TLR4 mRNA和蛋白表达量、NF-KB活性、穿膜细胞数、MMP-9 mRNA和蛋白表达量均显著低于LPS组(t值分别为-4.437、-14.805、-10.506、-9.700、-9.055、-8.932,P值均＜0.01).结论 TP具有抑制胰腺癌细胞侵袭的作用,其机制与抑制TLR4/NF-kB信号通路、下调MMP-9的表达有关.     

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3;选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞;实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率;G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001);TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.     

胰腺癌中三种血管生长因子受体的表达研究

目的：胰腺癌能依赖多种血管生长因子及受体的多步骤调控导致肿瘤血管大量生长。探讨血管内皮生长因子受体（flt-1)，碱性成纤维细胞生长因子受体（bFGFR)及血小板衍生生长因子受体（PDGFR）与胰腺癌生物学行为的关系及受体之间相互关系。方法：应用免疫组化方法检测51例胰腺癌及32例急慢性胰腺炎患者病变组织中，flt-1、bFGFR、PDGFR的表达。结果：flt-1、bFGFR、PDGFR在胰腺癌患者中的阳性率为52．9％，54．9％和45．1％，在胰腺炎中的阳性率为18．8％，18．8％和21．9％，差异均有显著性（P＜0．05或P＜0．01），它们的高表达与胰腺癌的分化程度呈负相关（P＜0．05或P＜0．01），与肿瘤大小无关（P＞0．05）。flt-1、bFGFR、PDGFR在胰腺癌中阳性表达呈相关密切关系（P＜0．05），它们在胰腺癌的发生、浸润、转移中可能存在相互诱导，相互诱导协同或互补作用。结论：flt-1、bFGFR、PDGFR的阳性表达可作为胰腺癌生长，转移及预后的重要判定指标，三种血管生长因子受体可作为胰腺癌抑血管生成治疗的有效靶点。     

TLR2 and TLR4 polymorphisms influence mRNA and protein expression in colorectal cancer

AIM: To evaluate the effect of promoter region polymorphisms of toll-like receptor(TLR)2-196 to-174 del and TLR4-1607T/C(rs10759932) on m RNA and protein expression in tumor tissue and of TLR4+896A/G(rs4986790) on colorectal cancer(CRC) risk.METHODS: The TLR2-196 to-174 del polymorphism was investigated using allele-specific polymerase chain reaction(PCR) and the TLR4-1607T/C and TLR4+896A/G by PCR-restriction fragment length p o l y m o r p h i s m( R F L P). W e g e n o t y p e d 4 3 4 D N A samples from 194 CRC patients and 240 healthy individuals. The m RNA relative quantification(RQ) was performed in 40 tumor tissue samples by quantitative PCR Taq Man assay, using specific probes for TLR2 and TLR4 genes, and ACTB and GAPDH reference geneswere used as endogenous controls. Protein expression was analyzed by immunohistochemistry with specific primary antibodies.RESULTS: No association was found for TLR4-1607T/C and TLR4+896A/G by three statistical models(logadditive, dominant and recessive). However, based on dominant and log-additive models, the polymorphic variant TLR2-196 to-174 del was associated with increased CRC risk [dominant: odds ratio(OR) = 1.72, 95%CI: 1.03-2.89; P = 0.038 and log-additive: OR =1.59, 95%CI: 1.02-2.48; P = 0.039]. TLR2 m RNA expression was increased in tumor tissue(RQ = 2.36) when compared to adjacent normal tissue(RQ = 1; P 0.0001), whereas the TLR4 m RNA showed a basal expression(RQ = 0.74 vs RQ = 1, P = 0.452). Immunohistochemistry analysis of TLR2 and TLR4 protein expression was concordant with the findings of m RNA expression. In addition, the TLR2-196 to-174 del variant carriers showed m RNA relative expression 2.19 times higher than wild-genotype carriers. The TLR2 protein expression was also higher for the TLR2-196 to-174 del variant carriers [117 ± 10 arbitrary unit(a.u.) vs 95 ± 4 a.u., P = 0.03]. However, for the TLR4-1607T/C polymorphism no significant difference was found for both m RNA(P = 0.56) and protein expression(P = 0.26).CONCLUSION: Our findings suggest that TLR2-196 to-174 del polymorphism increases TLR2 m RNA expression and is associated with higher CRC risk, indicating an important role in CRC genetic susceptibility.     

12-脂氧合酶在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胰腺癌组织和胰腺癌细胞株SW1990和PANC1的12-脂氧合酶(12-lipooxygenase,12-LOX)表达,探讨其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 分别应用免疫组化染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测胰腺癌组织、癌旁正常胰腺组织及胰腺癌细胞株SW1990和PANC1中12-LOX mRNA和蛋白的表达.分析胰腺癌组织12-LOX表达与临床病理参数的相关性.结果 30例胰腺癌组织12-LOX表达阴性8例,弱阳性7例,强阳性15例,总阳性率为73.3％.SW1990和PANC1细胞均表达12-LOX.阳性表达的胰腺癌组织及两株胰腺癌细胞株均表达12-LOX mRNA,而癌旁正常胰腺组织不表达12-LOX mRNA及蛋白.胰腺癌组织12-LOX强阳性表达与肿瘤TNM分期、肿瘤病理分级和淋巴结转移相关(P＜0.05),而与患者年龄、性别无关.结论 12-LOX在胰腺癌中表达上调,与胰腺癌的恶性生物学行为有关.