高分辨率熔解曲线分析检测家蝇kdr基因突变

目的探讨kdr基因在家蝇溴氰菊酯抗性增加中的作用。方法首次将高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析与半定量PCR相结合,用于分析家蝇抗性基因kdr扩增和突变情况。对扩增的PCR产物进行测序来验证HRM准确性。结果与敏感品系家蝇相比,kdr的mRNA表达量在现场品系家蝇中没有显著改变(P>0.05)。使用HRM对kdr进行突变分析,发现所有样本均为同一基因型。经核酸测序,该扩增片段没有突变位点。结论杭州家蝇溴氰菊酯抗性增加与kdr基因无关。     

应用高分辨率熔解曲线检测MTHFR和MTRR基因多态性

目的 探讨高分辨率熔解曲线(HRM)对单核苷酸多态性位点(SNP)检测的准确性,为新生儿出生缺陷相关基因多态性的快速检测与治疗提供参考.方法 收集正常血样,抽取血液DNA并定量.设计亚甲基四氢叶酸还原酶(MTH-FR)两个SNP位点c.677 C＞T和c.1298 A＞C和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的一个SNP位点c.66 A ＞G的特异性HRM引物,利用HRM法对其进行检测,然后取部分样本测序,比较检测结果,并进行HWE检验.结果 经HRM法,96例未知基因型的样本中,MTHFR c.677 C＞T位点检测61例为C/C型,31例为C/T型,4例为T/T型;MTHFR c.1298 A＞C位点检测出50例为A/A型,30例为A/C型,16例为C/C型;对MTRR c.66 A＞G位点检测出51例为A/A型,40例为A/G型,均与测序结果一致.结论 HRM可快速准确且高通量地检测新生儿出生缺陷相关基因多态性,是一种简便和准确的可应用于临床的检测方法.     

用高分辨率熔解曲线做PCR条件优化

目的:确定高分辨率熔解曲线分析方法可用于PCR条件优化。方法:对家蝇抗性基因cyp6d1和kdr进行温度梯度PCR,其产物分别使用高分辨率熔解曲线分析和溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳方法判定最佳退火温度,并将结果进行比较分析。结果:根据高分辨率熔解曲线判定cyp6d1和kdr基因的最佳退火温度分别为65℃和63.8℃,与根据溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳判定的退火温度相同。结论:可用高分辨率熔解曲线判断PCR最佳退火温度。     

高分辨率熔解曲线技术检测耐利福平结核杆菌

目的建立1种基于荧光定量PCR扩增原理的联合高分辨率熔解曲线技术(qPCR-HRM),用于耐利福平结核杆菌(RR-TB)的快速检测。方法选取GenBank中结核杆菌rpoB基因序列(利福平耐药决定域),分别设计2对特异性引物rpoB-1R/F、rpoB-2R/F扩增rpoB基因的不同片段,构建荧光定量PCR反应体系,加入HRM饱和荧光染料监测扩增产物进行HRM分析。以H_(37)R_a菌株为阴性对照,检测240株临床诊断肺结核培养菌株对利福平(RFP)的耐药性;以传统的药敏实验结果为金标准,对qPCR-HRM法检测RR-TB的灵敏度、特异度、重复性进行评估。结果 qPCR-HRM法检测RR-TB灵敏度为84.8%,特异度为96.5%,批内、批间变异系数均1%,检测时间为2h以内。结论 qPCR-HRM法检测RR-TB耗时较短、特异度强、灵敏度高、快速易操作,适合在有条件的基层医疗机构进行推广。     

高分辨率熔解曲线分析检测家蝇cyp6d1基因突变

目的 探讨家蝇溴氰菊酯抗性机制.方法 使用高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析与半分析定量PCR相结合的方法,分析家蝇抗性基因cyp6d1突变和扩增情况.通过对扩增的PCR产物进行测序来验证HRM准确性.结果 与敏感品系相比,抗性品系cyp6d1基因的mRNA表达量显著增加(P=0.0002),抗性品系cyp6d1基因的mRNA表达量是敏感品系的50.7倍;使用HRM对cyp6d1进行突变分析,将其分为3种基因型,分别为A型(Tm=85.5℃)、B型(Tm=87.3℃)和C型(Tm=88.5℃);经测序,该HRM分析结果分别与3类基因序列型相对应.A型基因型为纯合的1087G、1101T和1155A(对应GenBank序列号U22367.1);C型基因型为纯合的1087A、1101G和1155G;B型基因型为A型和C型的杂合型.生物信息学分析表明,该突变为无意义突变.结论杭州市家蝇抗性品系cyp6d1基因mRNA表达量显著增加,可能是家蝇抗性增加的原因之一.     

高分辨率熔解曲线分析技术在非缺失型α-地中海贫血新生儿筛查中的前瞻性应用

目的:验证高分辨率熔解曲线分析技术(HRM技术)用于筛查非缺失型α-地中海贫血的可行性。方法:应用全自动毛细管电泳技术对6 525例新生儿脐血进行血红蛋白定量分析,将Hb Bart's含量在0.1%～2.5%的样本挑出,排除3种常见缺失型α-地贫基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)后剩下的样本,用HRM技术分别对α-基因的3个外显子进行扫描后对这些样本进行基因确诊。结果:所有28例非缺失型α-地中海贫血全部被检出。结论:HRM技术可作为非缺失型α-地中海贫血的一种筛查方法,且具有准确、高效、低成本的优点。     

高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便基因突变与临床病理参数的关系

目的初步探讨高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便DNA突变与临床病理参数的关系。方法收集2009年3月～2009年9月在本院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1g,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、P53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析。结果大肠癌患者粪便中APC、K-ras、P53基因的突变与大肠癌患者性别、年龄、分化状态、病变部位、Dukes分期和有无淋巴结转移无关。结论未发现粪便APC、K-ras和P53基因突变情况与大肠癌患者的临床病理参数具有相关性。     

血小板抗原HPA-2基因分型熔解曲线法分析

目的建立熔解曲线分析法进行HPA-2基因分型,并检测大连地区汉族人群HPA-2等位基因频率。方法实时荧光PCR后用熔解曲线分析法进行HPA-2基因分型,与常规PCR-SSP方法进行比较,用熔解曲线分析法对辽宁地区155名汉族血小板捐献者的HPA-2系统进行基因分型,获得HPA-2等位基因分布数据,并与国内部分地区的人群进行比较。结果基因型为HPA-2aa的样本,熔解曲线呈现单一的峰型,Tm值在(85±1) ℃;基因型为HPA-2ab的样本熔解曲线呈现双峰型,Tm值在(80±1) ℃和(85±1) ℃;基因型为HPA-2bb的样本熔解曲线呈现单一的峰型,Tm值在(80±1) ℃。熔解曲线分析法基因分型结果与PCR-SSP法完全一致。大连地区汉族人群HPA-2a、HPA-2b等位基因频率分别为0.9161,0.0838。与南京、上海、新疆地区汉族人群以及新疆地区维吾尔族人群均很相似(P>0.05),但与海南黎族人群相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论应用熔解曲线分析法进行HPA-2基因分型具有简单、快速、准确等优点,优于常规的PCR-SSP方法;HPA-2等位基因频率分布在国内存在种族差异。     

高分辨熔解曲线检测潮汕汉族人群的载脂蛋白E基因多态性

目的研究载脂蛋白E(apo E)基因单核苷酸多态性各等位基因及基因型在潮汕汉族人群中的分布频率,比较其在不同种族间分布的差异。方法采用高分辨熔解曲线分型技术检测100例潮汕地区汉族人群的Apo E基因rs429358和rs7412多态性。PCR-测序法作为金标准进行比对。结果在潮汕地区汉族人群中存在Apo E基因rs429358和rs7412多态性。潮汕人的Apo E基因型分布以E3/E3最常见,其次为E4/E3。与非洲及欧洲人群比较,Apo E基因多态性的分布频率均存在显著性差异(P<0.05);而与中国汉人比较差异无显著性(P>0.05)。结论采用高分辨熔解曲线法进行Apo E基因多态性检测,其操作简便省时,不易交叉污染;获得的各种基因类型特征性强,适用于临床陕速诊断分型和遗传学人群研究。Apo E的3种常见等位基因频率分布存在地域差异。     

应用高分辨率熔解曲线技术检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因变种stx2c

目的:探索高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析技术在检测大肠埃希菌O157:H7志贺毒素基因变种stx2c中的应用。方法:用HRM技术对20株O157:H7代表性菌株志贺毒素2基因进行分型,并与测序结果进行比较。结果:20份O157:H7样品中有3种类型熔解曲线。测序结果显示,12例A型熔解曲线中除1例为stx2a+stx2c杂合型外,其它均为原毒素基因型stx2a;1例B型熔解曲线测序结果为stx2a+stx2c杂合型,7例C型熔解曲线菌株测序结果均为stx2c纯合子。结论:HRM技术简便、快速,可作为志贺毒素2基因变种stx2c的检测方法。     

Association of genetic variants with anti-tuberculosis drug induced hepatotoxicity: A high resolution melting analysis

BackgroundTuberculosis (TB) treatment remains a challenge owing to the high incidence of drug induced hepatotoxicity (DIH). Apart from environmental factors, single nucleotide polymorphisms (SNPs) in drug metabolizing enzymes (DMEs), nuclear receptors (NRs) and transporter proteins (TPs) contribute to DIH. In the present study, we report known and novel SNPs in a total of seven genes of DMEs, NRs and TPs with high resolution melting (HRM) technique.MethodsDNA samples of 185 TB patients of Western Indian population, of which 50 showed DIH, were analyzed. Grouping of the temperature-shifted difference plots obtained from the DNA melt curves enables identification of known and novel SNPs. Representative samples of each group were sequenced.ResultsWe report 18 novel SNPs, of which 3 are in 5′-UTR, 14 in exonic and 1 in intronic region. Of the SNPs in exons, 7 non-synonymous, 3 synonymous and 4 deletion mutations were observed. Among the known SNPs, CYP2E1 wild-type, NAT2¹5 mutant and NAT2¹6 heterozygous genotypes were associated with DIH (p < 0.05). Among the novel SNPs, group 2 of SLCO1B1 showed a significant association (p < 0.05).ConclusionsWhile several SNPs showed borderline p values between 0.05 and 0.15, the confidence in association can be improved further by using larger data sets.     

Rapid detection and differentiation of Theileria annulata,T. orientalis and T. sinensis using high-resolution melting analysis

Bovine theileriosis, caused by protozoan parasites of the genus Theileria, presents with various clinical symptoms. In cattle, clinical presentations and outcomes of bovine theileriosis are closely correlated with the causative Theileria spp. Thus, accurate detection and discrimination of Theileria spp. are essential for epidemiological studies and for provision of clinical management strategies. High-resolution melting (HRM) analyses of two amplicons targeting the 18S rRNA indicated that T. annulata, T. orientalis, and T. sinensis isolated from China can be accurately detected and discriminated with the lowest detection limit of 1–10 copy numbers of plasmid bearing the 18S rRNA sequence. The approach was verified with DNA samples from experimentally infected cattle and field samples. Thus, this assay is useful for diagnosis of bovine theileriosis in field samples and experimentally infected animals, and could also be applicable for the survey of parasite dynamics, epidemiological studies.     

高分辨荧光熔解曲线法检测脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失

目的探讨高分辨荧光熔解曲线分析在SMNt基因7号外显子缺失检测中的应用。方法用高分辨荧光熔解曲线分析方法分析脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子纯合缺失、SMNc基因7号外显子纯合缺失及未见SMNt、SMNc完全缺失三种情况。结果高分辨荧光熔解曲线分析方法能很好地区分SMNt基因7号外显子纯合缺失、SMNc基因7号外显子纯合缺失及未见SMNt、SMNc完全缺失三种基因型,与基因测序方法所得的结果完成一致。结论高分辨荧光熔解曲线法可用于脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失检测,具有快速、准确、可靠的特点。     

荧光PCR熔解曲线法分析宜昌地区非结核分枝杆菌感染的流行特征

目的 应用荧光PCR熔解曲线法分析宜昌地区非结核分枝杆菌(NTM)的感染趋势、分布特征、流行状况,为该地区NTM感染的防治提供参考依据。方法 收集2016—2020年间宜昌地区在某院就诊的疑似结核病患者的胸腔积液、腹腔积液、痰、支气管肺泡灌洗液标本,经萋-尼抗酸染色涂片、MGIT 960快速培养和改良罗氏培养检出的所有分枝杆菌阳性标本进一步经荧光PCR熔解曲线法鉴定结核分枝杆菌(MTB)及NTM菌种。以全基因组测序(WGS)为金标准,对比分析荧光PCR熔解曲线法鉴定MTB及NTM的准确性,总结该地区NTM感染患者的临床特征。结果 共收集7 496份分枝杆菌阳性标本,经荧光PCR熔解曲线法鉴定,检出6 997株(93.34%)MTB与499株(6.66%)NTM。NTM菌种鉴定共确定469株(93.99%)NTM菌种,其余30株(6.01%)为未知菌种。检出最多的NTM为胞内分枝杆菌(189,37.88%),其次依次为脓肿分枝杆菌(68株,13.63%)、戈登分枝杆菌(25株,5.01%)。选择荧光PCR熔解曲线法鉴定的22株MTB和18株NTM行WGS,符合率为98.15%,灵敏度为9...     

华南汉族女性TNF-α基因多态与早产的相关研究

目的:研究肿瘤坏死因子(tum or necrosis facor,TNF)-α基因-308、+488位点单核酸多态性(single nucleotide polym orphism,SNP)与华南地区汉族女性早产的相关性,并探讨其与早产相关危险因素的交互作用。方法:应用病例对照研究方法,选取116例正常足月产妇及110例早产产妇为研究对象,采用聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)技术结合测序法检测其TNF-α基因-308、+488位点多态性分布,运用多因素Logistic回归等方法分析基因型和早产的关系以及与相关危险因素的交互作用。结果:①检测到对照组和早产组的TNF-α基因-308位点基因型GG、GA、AA频率分布均为84.5%、15.5%和0%,+488位点基因型GG、GA、AA频率分别为78.5%、19.8%、1.7%和69.1%、28.2%、2.7%,两组基因型分布频率和等位基因频率比较差异无统计学意义(P0.05)。②TNF-α基因产妇有家族早产史、孕期阴道炎、胎膜早破为早产的危险因素,TNF-α基因-308位点GA基因型对家族早产史、孕期阴道炎、胎膜早破的暴露效应有放大作用,+488位点GA+AA基因型对胎膜早破、家族早产史的暴露效应也有放大作用,交互作用系数(r)均1,均为超相乘交互模型。结论:TNF-α基因+488位点GA+AA基因型和-308位点GA基因型与华南汉族女性早产的危险性相关,且与胎膜早破、家族早产史存在一定的交互作用。     

一种基于HRM技术的快速DNA甲基化检测方法

目的:建立经济可靠的基于MS-HRM技术的检测DNA甲基化的方法。方法:采用简单的沉淀法纯化回收Bis-DNA(重亚硫酸钠处理后的DNA),首次采用picogreen为MS-HRM分析染料,并用新建立的方法检测结直肠癌患者组织SEPT9启动子甲基化水平。结果:新方法的回收率在63%以上,纯度、得率都显著优于经典方法中的Promega Wizard DNA Clean-up System,Picogreen染料可检测到低至0.5%甲基化。共检测34例结直肠癌组织,其中SEPT9异常甲基化的组织33例,占97%,检出率高于文献报导。结论:本文建立的方法简单快速、灵敏度高、重复性好、经济、可操作性强的优点。     

岳阳市汉族造血干细胞捐献志愿者HLA-DRB1高分辨基因多态性研究

目的检测中华骨髓库湖南分库岳阳市汉族造血干细胞捐献志愿者HLA-DRB1高分辨基因型,了解其基因频率和基因多态性分布特点。方法采用DNA序列测定的分型技术,对1 381名汉族志愿者进行HLA-DRB1高分辨基因分型。结果检出236种HLA-DRB1基因型,主要基因型为0901/0901（4.63%）、0901/0803（4.42%）、0901/1202（4.42%）、0901/1501（4.27%）,基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。检出43种HLA-DRB1等位基因,前5位依次为DRB1＊0901（19.41%）、DRB1＊1501（10.79%）、DRB1＊1202（8.98%）、DRB1＊0803（7.49%）、DRB1＊0405（5.47%）,前5位等位基因频率分布与中华骨髓库湖北分库汉族人群比较,差异无统计学意义;与中华骨髓库北方汉族人群比较,差异有统计学意义。结论本资料从高分辨基因分型水平反映了岳阳汉族人群HLA-DRB1的分布情况,对指导HLA-DRB1与疾病的预测和预防、临床寻找HLA匹配的无关造血干细胞捐献者和我国人群群体遗传性研究等有重要意义。