纳米金颗粒质量放大压电DNA传感器频移信号的研究

目的探讨纳米金颗粒质量放大压电DNA传感器频移信号的可行性,以进一步提高检测灵敏度。方法将巯基化的单链DNA探针固定于压电DNA传感器石英晶体金膜表面,封闭后加入合成的生物素化的互补靶DNA与之进行杂交反应,最后用5nm粒径的链亲和素标记的胶体金追加标记于杂交后的生物素化的靶DNA上,以增加石英晶振金膜表面的质量负载,从而降低石英晶振的响应频率,进一步放大频移信号。结果检测终浓度为10-8mol/L的阳性靶序列时杂交反应前后频移为(12.7±5.5)Hz,加入终浓度为9%的纳米金颗粒放大后总频移为(126±2.6)Hz,后者显著高于前者(P<0.01)。另外,对不同终浓度的阳性靶序列检测后发现,频移与其终浓度的lg值之间具有显著的线性关系,相关系数为0.974,而且最低检出限达到了10-12mol/L。结论实验结果表明该方法可以显著放大压电DNA传感器的频移信号,从而进一步提高压电DNA传感器检测的灵敏度。     

"RecA蛋白-互补单链DNA探针"生物信号放大系统用于压电基因传感器的研究

目的利用"RecA蛋白-互补单链DNA探针"与固定的肽核酸(bis-PNA)探针相结合,摸索最适的液相反应条件,以提高压电基因传感器基因传感表面的质量负载,从而提高传感器的灵敏度.方法基因传感器阵列固定上针对乙肝病毒的bis-PNA探针,加入靶DNA与之反应,然后加入预先处理过的不同浓度(0.5～6mg/ml)的"RecA蛋白-互补单链DNA探针".结果当RecA蛋白浓度为3mg/ml时,ATPγS浓度为12.5μM,所引起的频率变化最显著.结论在反应体系中加入"RecA蛋白-互补单链DNA探针",有效的提高了压电基因传感器的灵敏度.     

2种不同类型的核酸探针对压电基因传感器阵列检测特异性的影响

目的探讨用PNA作为探针与普通的DNA探针相比对压电传感器基因杂交的优越性.方法用生物素-亲和素法分别将PNA、DNA两种探针固定在基因传感器的金膜表面,分别与完全匹配、1个碱基错配、2个碱基错配的互补靶序列进行杂交,观察2种不同的探针与靶序列反应所引起的频率变化及所用的时间.结果相对于DNA探针,PNA探针识别碱基错配的能力明显高,且杂交时间更短.结论 PNA与靶序列DNA结合有高度的特异性,选用PNA作探针,可提高压电基因传感器检测的特异性.     

核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌的实验研究

目的 构建一种用于检测金黄色葡萄球菌的核酸外切酶-压电石英DNA传感器新方法,同时对其重要影响因素进行探讨.方法 采用λ核酸外切酶处理金黄色葡萄球菌PCR产物,EB染色、电泳后于紫外灯下进行观察,对杂交温度、杂交时间和杂交响应性能等因素进行实验研究,进一步将构建的核酸外切酶-压电石英DNA传感器法用于金黄色葡萄球菌检测,并对其灵敏度和特异性进行研究.结果 λ核酸外切酶-压电石英DNA传感器法最适杂交温度为35℃,最适杂交时间为60 min,响应性能显著大于普通压电DNA传感器(P＜0.01),可以检测到1.0×104CFU/ml的金黄色葡萄球菌,特异性好.结论 利用核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌,具有杂交效率高、技术难度低、频率响应性能高等优点,有较好的应用前景.     

适配子型压电石英晶体传感器探针固定方法的研究

目的 比较金膜表面两种探针固定法的优劣,选择适配子型压电传感器探针固定的最佳方法.方法 用巯基固定法及生物素-亲和素固定法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面,对不同浓度IgE引起的频率变化进行检测.结果 与巯基法相比,生物素-亲和素法固定探针压电传感器频率下降更为明显,检出限低,线性范围宽,0.1～2.5 mg/L浓度范围内IgE浓度与频率变化呈明显的线性相关,相关系数0.994 5.结论 在压电基因传感器探针固定中效果良好的巯基法在适配子探针固定中并不适用,生物素-亲和素法在适配子压电传感器探针固定中有明显优势.     

探针浓度对蛋白质-DNA相互作用新型压电生物传感器的影响

目的 探讨不同探针浓度对蛋白质-DNA相互作用新型压电生物传感器结合效应的影响.方法 将6种不同浓度NF-κB顺式作用元件(DNA)探针通过巯基化法固定在传感器的金膜表面,并与特异性蛋白NF-κB 的p65亚基进行结合反应,通过计算机采集分析传感器频率数据,观察不同浓度探针与p65亚基结合反应所引起的频率变化及反应所需的时间.结果 在DNA顺式作用元件探针浓度为0.25～3.0μmol/L的范围内,随着探针浓度的增加,p65蛋白与DNA探针结合反应所引起的传感器频率变化逐渐增加,当探针浓度为2.0μmol/L时所引起的频率变化与探针浓度为3.0μmol/L所引起的频率变化差异无统计学意义(P>0.05);同时p65蛋白与DNA的结合反应平衡时间随着探针浓度的增加有缩短趋势,当探针浓度为2.0μmol/L时,结合反应平衡时间最短为15min.结论 随着DNA探针浓度的增加,蛋白质-DNA结合反应引起的频率下降呈典型的饱和曲线趋势,探针浓度为2.0μmol/L、反应时间为15min,是蛋白质-DNA相互作用压电生物传感器的最适结合反应条件.     

漏声表面波传感器生物信号放大系统的研究

目的 研究利用"RecA蛋白-互补单链DNA"探针与bis-PNA/dsDNA复合物相结合,作为生物信号放大系统提高传感器检测灵敏度的可行性.方法 漏声表面波传感器检测通道金膜表面先固定针对人乳头瘤病毒(HPV)的bis-PNA探针,加入HPV基因组DNA与之完全反应后,再加入不同浓度的"RecA蛋白-互补单链DNA"探针,在反应过程中加入ATPγS提供能量,分别探索优化RecA蛋白及ATPγS的最佳反应浓度.结果 当RecA蛋白浓度为45 μg/ml,所引起的相位变化值为(11.74±1.03)°,显著高于其他浓度组(P＜0.01);在最佳RecA蛋白浓度下,当ATPγS浓度为2.5 mmol/L时,所引起的相位变化值为(10.71±0.73)°,显著高于其他ATPγS浓度组(P＜0.01).结论 "RecA蛋白-互补单链DNA"探针复合体与bis-PNA/dsDNA复合物相结合可以有效提高传感器的检测灵敏度,并明显缩短检测时间.     

靶DNA长度对压电传感器基因杂交效应的影响

目的：探讨靶DNA长度对压电传感器基因杂交效应的影响，方法：在压电传感器阵列上固定20碱基的巯基DNA序列作为探针后分别与不同长度的含互补片段的靶序列进行杂交，计算机采集并分析传感器频率数据，比较各靶DNA长度下杂交达到平衡所需时间，杂交前后频率差，并计算杂交动力学参数。结果：随靶DNA长度增加，杂交时间有延长趋势。在靶DNA长度为20－108个碱基时，其频率变化值与碱基数呈线性关系。而225，379，654个碱基时的频率变化反应则明显降低，结合常数变化不明显，而解离常数呈增大趋势变化，使平衡常数逐渐减少，结论：在威武央晶体传感器阵列上，频率变化值随靶序列长度增长而增大但反应效率不一样。     

基于"单碱基延伸和酶放大系统"的SNP漏声表面波生物传感器的实验研究

目的探讨漏声表面波生物传感器检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的方法。方法分别在漏声表面波生物传感器反应体系加入2条仅存在一个碱基不同(A/G)的靶序列,与固定的探针杂交。利用酶生物信号放大系统,结合单碱基延伸技术,观察其杂交信号的改变。结果靶位点为完全匹配的A时,相位下降(6.47°±0.42°);而靶位点为错配的G时,相位下降仅为(0.77°±0.25°),两者差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功建立了漏声表面波生物传感器检测SNP的新方法。     

链延伸反应提高压电基因传感器的灵敏度的实验研究

目的　利用链延伸反应的原理延长引物链以提高压电基因传感器表面的质量负载 ,从而提高传感器的灵敏度。方法　基因传感器阵列表面分别固定上金黄色葡萄球菌mecA及femA两种探针片段 ,待杂交上相应的靶序列片段后 ,加入Klenow酶 ,室温下 (2 0℃左右 )进行链延伸反应 8h。结果　 50nmol L单链mecA在杂交反应及链延伸反应的过程中 ,频率的下降值分别为 (99.2± 8.5)Hz、(1 92 .9± 1 3 .3 )Hz。而femA则分别下降了 (1 42 .4± 1 1 .2 )Hz、(2 2 2 .6± 1 6.6)Hz。mecA、femA在链延伸反应前的检测灵敏度为 0 .5nmol L ,但经链延伸反应后检测灵敏度提高到了 0 .0 5nmol L。结论　链延伸反应有效地提高了压电基因传感器的灵敏度 ,可用于微量DNA的检测、核酸同源性分析等方面     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因克隆

目的 了解金黄色葡萄球菌的生物化学和代谢特征，以及其半乳糖醇酶与产生肠毒素的关系。方法 利用PCR方法从金黄色葡萄球菌标准株中扩增出金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶，克隆到pmD-18T载体上并转化到E．coli．JM109菌株。结果 用特异引物扩增800bp的基因片段，目的基因被克隆，经双酶切和DNA序列测定为金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因。结论 金黄色葡萄球菌半乳糖醇酶基因片段可以被特异性扩增和克隆。     

混合菌基因组的合并提取及鉴定

目的为了简便、快速的提取混合病原菌的基因组DNA，进而获得不同病原菌的特异性毒力DNA片断用于进一步的基因诊断。方法改良了裂解试剂，同时提取革兰氏阳性菌(以金黄色葡萄球菌为代表)和革兰氏阴性菌(以产毒性大肠杆菌ETEC为代表)的混合基因组DNA；采用双重PCR法进行扩增鉴定。结果提取得到混合菌的混合基因组，并以此为模板通过双重PCR同时扩增得到两种菌的特异性DNA片断。结论这是一种合并提取混合菌基因组DNA，进而获得不同病原菌DNA片段的简便方法。     

尿路感染分离金黄色葡萄球菌生物膜形成能力及相关基因的分析

目的：探讨尿路感染分离金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力及相关基因分布,为预防和治疗临床感染提供理论基础。方法采用标准琼脂平板倍比稀释法检测最小抑菌浓度,菌落计数法检测细菌黏附能力,96孔板结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力,生物膜相关基因检测采用PCR扩增法。结果11株金黄色葡萄球菌临床株对青霉素和红霉素耐药率较高,而对万古霉素和呋喃妥因全部敏感。所有菌株都有较强的黏附能力,而生物膜形成能力一般。其中10株菌株扩增出icaAD和icaBC基因。结论尿路感染金黄色葡萄球菌的黏附能力和生物膜形成能力具有菌株差异性,ica是金黄色葡萄球菌生物膜形成的重要基因。     

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的　建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法　将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果　核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论　建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。     

PCR法检测葡萄球菌肠毒素A基因

目的 建立PCR方法快速检测葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)基因.方法 根据SEA基因的序列,设计PCR引物特异性扩增靶基因片段,对1株产SEA金黄色葡萄球菌和9株对照菌株进行PCR检测,评价其特异性和敏感性.另检测30株金黄色葡萄球菌SEA基因的携带情况.结果 建立PCR方法快速检测SEA基因,扩增产物长度为439bp.PCR反应体系中有29cfu的产SEA金黄色葡萄球菌即可检出SEA基因,30株分离的金黄色葡萄球菌中有10株携带有SEA基因.结论 PCR法可以快速、敏感地检测SEA基因,为金黄色葡萄球菌食物中毒诊断提供依据.     

双重实时荧光PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立

目的:建立一种能快速检测金黄色葡萄球菌,同时能快速鉴别是否具有耐甲氧西林基因的双重实时荧光PCR方法.方法:以金黄色葡萄球菌特异NUC基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,同时针对耐甲氧西林特异MecA基因设计另一对引物和探针;2条探针的5′端标记不同荧光报告基团(FAM和HEX),3′端标记荧光淬灭...     

Covalent attachment of DNA to glass supports using a new silane coupling agent and chemiluminescent detection

Summary A new kind of silane coupling agent, N-(β-aminoethyl)-γ-aminopropyl triethoxysilane, was used for DNA direct attachment on the surfaces of glass supports, then the immobilized DNA was hybridized with horseradish peroxidase (HRP)-labeled probe, and detected by using enhanced chemiluminescent method. In comparison with 7-aminopropyl triethoxysilane, the detection limits (S/N) of DNA were 10 pg and 75 pg respectively. Several experimental conditions of DNA attaching to glass supports were investigated, and the system of hybridization of nucleic acid on the surfaces of glass supports was developed. This project was supported by a grant from National Science Foundation of China (No. 39990570).     

金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的克隆和序列测定

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列，设计并合成一对特异性的引物。以鼠金黄色葡萄球菌临床分离株SA.m0109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM-T中，对重组质粒pGEM-NUC进行限制内切酶分析，PCR鉴定和克隆片段的序列测定。证实了克隆片段的可靠性。