小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建小鼠骨生成诱导因子（OIF）基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG（Puro-IRES-GFP）的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3μg/mL嘌呤霉素（puromycin）,连续7d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCVPIG-OIF-3FLAG的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。     

小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG（Puro-IRES-GFP）的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3 μg/mL嘌呤霉素（puromycin）,连续7 d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG 的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果 构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论 成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。     

人Ism1表达载体的构建及其在293T细胞的表达

目的:构建人Ism1基因真核表达载体,并验证其在真核细胞中的表达,为相关研究奠定基础。方法:采用高保真DNA聚合酶和GC缓冲液从A549细胞扩增获取人Ism1编码序列全长,经酶切、连接、转化后,挑取阳性克隆进行菌液PCR、双酶切,及测序鉴定;用构建成功的Ism1表达载体转染293T细胞,用实时定量RT-PCR检测Ism1表达水平。结果:构建的Ism1载体经菌液PCR,双酶切鉴定后,测序结果完全正确,载体转入293T细胞后,Ism1表达量显著上升。结论:成功构建能在真核细胞中表达的人Ism1基因载体,将为相关研究提供便利。     

IL-17E和IL-17F及其受体在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的：观察配体白细胞介素17E（IL-17E）、白细胞介素17F（IL-17F）及其受体白细胞介素17RB（IL-17RB）和白细胞介素17RC（IL-17RC）在肠炎、肠息肉及结直肠癌组织中的表达,探讨其与直结肠癌恶性度的关系。方法：收集15例肠炎、5例增生性肠息肉及30例结直肠腺癌组织病理标本,采用免疫组织化学染色法检测IL-17E、IL-17RB、IL-17F和IL-17RC在肠炎、肠息肉和肠癌组织中的阳性表达率,分析配体与受体阳性表达率的相关性以及配体阳性表达率与肠癌恶性度的关联。结果：IL-17E、IL-17F、IL-17RB和IL-17RC主要表达于腺上皮细胞、单个核细胞、血管内皮细胞和部分癌细胞;IL-17E在肠炎和肠息肉组织中的阳性表达率明显高于肠癌组织（P<0.05）,且随肠癌恶性度升高而降低;IL-17F在肠息肉和肠癌组织中阳性表达率明显高于肠炎组织（P<0.05）,且随肠癌恶性度的升高而升高;IL-17RB在肠炎及息肉组织中的阳性表达率明显高于肠癌组织（P<0.05）。与肠炎和肠息肉比较,肠癌组织中IL-17RC阳性表达率升高（P<0.05）。在肠癌组织中,IL-17F阳性表达率与IL-17RC阳性表达率呈正相关关系（r=0.667,P=0.001）。结论：IL-17F、IL-17RC、IL-17E和IL-17RB信号可能参与了肠癌的发生发展。     

人白细胞介素-17F基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人白细胞介素-17F基因，并构建含有该目的基因的重组原核表达载体，获得高效表达hIL-17F的基因工程菌。方法 利用RT-PCR法，以PHA活化的人外周血单个核细胞的总RNA为模板，扩增出hIL-17FFeDNA的编码序列，并分别亚克隆至pUCm-T载体和原核表达载体pGEX．5X-3中，进行PCR、酶切鉴定和DNA序列测定。将重组原核表达载体转化感受态大肠杆菌B121后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白，且Western印迹鉴定。结果 PCR产物大小及其单酶切鉴定均证明所克隆的基因是hIL-17F，DNA序列测定进一步证实与GeneBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-5X．3／hIL-17F，并在大肠杆菌中获得高效表达，约占菌体总蛋白的55％，且Western印迹证实确为目的蛋白。结论 该基因系国内首次克隆，hIL-17F基因重组体的构建和在大肠杆菌BL21中的高效表达，为进一步探讨其生物学活性和应用奠定了基础。     

辅助性T细胞17和调节性T细胞在哮喘小鼠中的失衡表达及其意义

目的探讨辅助性T细胞17(Th17)和CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg)的表达失衡在哮喘小鼠发病机制中的作用。方法将24只BALB/c小鼠随机分为哮喘组和正常对照组,每组12只。哮喘组采用卵白蛋白致敏和激发的方法制作小鼠哮喘模型,对照组用等量的生理盐水代替。采用体积描记法测定气道反应性;对BALF中炎性细胞进行计数;流式细胞术检测脾脏单个核细胞中Th17及Treg细胞占CD4+ T细胞比例;ELISA法检测BALF及肺匀浆中Th17及Treg相关细胞因子IL-17和IL-10水平。结果与对照组比较,哮喘组平均气道阻力显著升高(P0.01),Th17细胞比例显著升高[(5.68±1.99)%比(2.80±0.82)%,P0.01],而Treg细胞比例显著降低[(2.88±0.46)%比(6.10±2.44)%,P0.01],Th17/Treg比值显著升高(1.93±0.41比0.50±0.15,P0.01),BALF及肺匀浆中IL-17水平均显著升高[(22.37±3.00)pg/mL比(11.42±2.15)pg/mL,(52.93±5.39)pg/mL比(19.38±2.65)pg/mL,P均0.01],而IL-10水平均显著降低[(6.05±1.25)pg/mL比(14.23±2.94)pg/mL,(9.33±1.79)pg/mL比(21.40±2.44)pg/mL,P均0.01]。结论哮喘小鼠Th17细胞数量增多及IL-17水平增高,而Treg细胞数量减少及IL-10水平降低,Th17/Treg细胞比例失衡可能在哮喘的发病机制中具有重要作用。     

人LIGHT基因的克隆及其在293T细胞中的表达

目的克隆人LIGHT分子的全长cDNA,构建重组真核表达质粒pCI-neo-LIGHT并在293T细胞上获得稳定表达.方法从人T细胞cDNA文库中用PCR技术克隆人LIGHT全长cDNA,装入T-Easy载体,测序证实后,将LIGHT cDNA装入质粒pCl-neo中构建真核表达载体.用电穿孔法转染293T细胞,经G418筛选后,用流式细胞仪检测LIGHT分子的表达.结果测序证实克隆的LIGHT全长cDNA阅读框正确完整,酶切证实LIGHT-pCI-neo中LIGHT插入方向正确.转染的293T细胞经G418筛选3个月后,流式细胞仪检测有78.69%的细胞表达人LIGHT分子.结论成功克隆LIGHT基因并获得稳定表达膜型LIGHT分子的293T细胞系.     

pB2 R-Venus 重组真核载体的构建及在 HEK293T细胞中的表达

目的：构建带有黄色荧光蛋白突变体 Venus标签的人缓激肽2型受体（bradykinin receptor 2, B2R）真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3．1-B2R为模板,PCR扩增目的基因人B2R。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物及质粒pVenus-N1,经回收、连接、转化,获取重组质粒。对重组质粒进行酶切、测序鉴定。转染重组质粒至 HEK293T细胞,荧光显微镜观察受体B2R的细胞定位,蛋白印迹法检测目的蛋白人B2R蛋白的表达。结果 PCR扩增出了1条长度为1176 bp的基因片段,测序结果与GenBank （AY275465）相同。荧光显示B2R表达于质膜。Western blot结果显示,实验组蛋白印迹条带与目的蛋白大小相同,为44kDa。结论成功构建了pB2R-Venus重组真核表达载体,瞬时转染成功,获得了转染有重组质粒的HEK293T细胞。成功构建的重组质粒pB2R-Venus可用于后续BRET、FRET等实验研究,有助于B2R介导的信号转导机制的探讨和药物靶点的寻找。     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

人P58.1重组逆转录病毒载体的构建及其在淋巴细胞中的表达

目的构建人P58.1基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在淋巴细胞中的表达。方法由逆转录病毒栽体pMSCV介导，将白血病受者的P58．1基因导入健康供者的淋巴细胞中，并用逆转录聚合酶链式反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果测序及BglⅡ、EcoRⅠ双酶切鉴定证实，获得了P58.1基因且已正确插入载体pMSCV。流式细胞仪检测空载体、未转染及重组pMSCV转染供者淋巴细胞的P58．1分子表达率差异有显著性，重组逆转录病毒感染的供者淋巴细胞整合了受者的P58．1基因，且能转录为相应的mRNA并在细胞膜上有P58．1分子表达。结论成功获得P58．1基因并构建重组逆转录病毒载体，该基因已稳定整合入淋巴细胞的基因组中，且获得了表达。     

人促甲状腺激素受体HEK 293T细胞稳定表达株的构建

目的 构建人促甲状腺激素受体（hTSHR）稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药。方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒。转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达。用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒。qPCR测定包装病毒滴度。用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株。绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株。结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100%吻合。Western blot显示,过表达hTSHR的 HEK 293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带。qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108 TU/mL。GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光。结论 构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-hTSHR-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料。     

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h 和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达.结果 成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106 PFU/ mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达.结论 含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具.     

p53RFP 表达载体的构建及其对HEK293A细胞增殖的抑制作用

  目的 构建p53RFP 表达载体,观察p53RFP 表达上调对HEK293A细胞生长的影响。方法 利用DNA克隆技术,将人p53RFP基因的编码序列克隆至质粒pcDNA 4/Myc-HisA,经限制性酶切、DNA测序鉴定重组载体。质粒扩增提取,经脂质体介导法转染HEK293A细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测转染后p53RFP mRNA及蛋白的表达水平。采用CCK-8检测p53RFP 表达上调对HEK293A细胞增殖的影响。结果 p53RFP转染后其mRNA及蛋白表达水平均显著上调;p53RFP转染后72 h、96 h细胞增殖受到显著抑制（P<0.01)。结论 成功构建p53RFP表达载体pcDNA 4/-p53RFP,并可在HEK293A细胞有效表达,其表达可抑制HEK293A细胞增殖。     

重组逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI基因在肌源细胞中的表达

目的 探索一种安全有效的载脂蛋白ＡＩ基因表达系统。方法 构建含人载脂蛋白ＡＩ ｃＤＮＡ的双顺反子逆转录病毒载体ｐＬＡＥＮ,用其转化小鼠原代肌母细胞及肌源性细胞Ｃ２Ｃ１２,ＥＬＩＳＡ法检测细胞液中人载脂蛋白ＡＩ的含量。结果 转化后的小鼠原代肌母细胞及Ｃ２Ｃ１２细胞在分化为肌管细胞后均获得异源表达人载脂蛋白ＡＩ的能力;而且经Ｇ４１８筛选也获得稳定转化的Ｃ２Ｃ１２细胞株,３０天后仍保持有效表达人载脂蛋白     

人硫氧还蛋白基因克隆及其重组逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的 克隆人硫氧还蛋白（hTRX）基因,并构建含有该目的 基因的重组逆转录病毒载体。方法 利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞总RNA为模板,扩增hTRX编码蛋白的cDNA基因,并亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1中进行PCR、双酶切和测序鉴定。结果 将所得的序列与GenBank（BC003377）报道的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）与已知序列一致,第132、136、170、264位碱基与已知序列不同,其中第136、170位相应密码子编码的氨基酸发生了变化（Phe→Leu,Ile→Thr）,成功获得了pSIV-1-hTRX重组逆转录病毒载体。结论 hTRX基因的克隆及其重组逆转录病毒载体pSIV-1-hTRX的构建,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定了基础。     

逆转录病毒载体PLIL-2SN转导人CD3AK细胞方法的建立

目的 :探讨CD3AK细胞在基因治疗中的应用 ,并对逆转录病毒载体转导CD3AK细胞IL 2基因的方法进行研究。方法 :利用逆转录病毒载体PLIL 2SN向人CD3AK细胞中导入IL 2基因。结果 :从转导细胞中RT PCR扩增出 347bpNeoR 基因特异性片段 ,并测出培养上清液中IL 2浓度为 3 .2 76 μg·L-1。结论 :转导的IL 2基因得到表达 ,转导成功。这有助于进一步研究转导后淋巴细胞的功能 ,以开展基因免疫治疗的研究     

结直肠癌患者癌组织中IL-17A和IL-17F的表达及意义

目的:探讨结直肠癌患者癌组织中IL-17A和IL-17F的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法检测88例术前未行放疗或化疗的结直肠癌手术患者癌组织中IL-17A和IL-17F的表达水平,并分析其与发病年龄、性别、组织学分型、TNM临床分期以及淋巴结转移的关系。结果:IL-17A和IL-17F的表达水平,癌组织均较癌旁组织显著增高[IL-17A:(17.03±5.87)%比(2.34±1.27)%;IL-17F:(15.03±6.41)%比(2.70±1.58)%,P<0.05],与患者年龄、性别、组织学类型无明显相关性(P>0.05),但与分化程度、肿瘤临床分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论:结直肠癌患者癌组织中IL-17A、IL-17F高表达,二者与结直肠癌的发生发展密切相关。     

IL-24 cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的 建立转染人白细胞介素-24(hIL-24)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-24的表达情况.方法 将携带人白细胞介素-24的质粒peDNA3.1( )-hIL-24转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Western blot和ELISA法对hIL-24的表达进行检测.结果 IL-24基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达.RT-PCR电泳结果显示hIL-24基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-24的含量为162.8±15.4 pg/mL,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-24.结论 hIL-24基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达.     

IL-17BR在人血管内皮细胞和哮喘患者气道黏膜组织中的表达

目的检测人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)和哮喘患者支气管黏膜组织白细胞介素-17BR(IL-17BR)(IL-25受体)的表达情况,为深入探讨IL-25是否参与哮喘发生发展和气道重塑提供实验依据。方法采用免疫细胞化学方法检测HUVEC能否表达IL-17BR;采用RT-PCR和Real-time PCR检测HUVEC接受IL-25(1μg/L)刺激前后IL-17BR基因表达水平的变化;采用亲和素-生物素复合系统检测哮喘患者支气管活检组织中IL-17BR的表达情况。结果HUVEC可组成性表达IL-17BR,接受IL-25(1μg/L)刺激后,IL-17BR(IL-25R)基因表达水平显著升高;哮喘患者支气管活检组织中有大量IL-17BR阳性细胞,而正常对照人群相应活检组织中仅有极少数IL-17BR阳性细胞。结论HUVEC和支气管黏膜组织可组成性表达IL-17BR,提示人血管内皮细胞和黏膜组织中IL-17BR阳性细胞有可能通过表面IL-17BR与IL-25结合相互作用参与哮喘的发生发展过程。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。