乙肝患者肝组织及外周血单个核细胞HBV DNA检测

用PCR方法对148例乙肝患者的肝组织及外周血单个核细胞HBV DNA进行检测，同时对肝组织进行病理组织学诊断。结果显示：148例乙肝患者的肝组织与PBMC内HBV DNA的检出率有一致性倾向，PBMC内HBV DNA的检出率与肝组织的损害程度呈正相关。     

乙型肝炎病毒感染孕妇的外周血单个核细胞在宫内感染中的作用

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）感染孕妇的外周血单个核细胞（PBMC）在宫内感染中的作用.方法选择血清HBV DNA阴性且PBMC HBV DNA阳性孕妇及其新生儿30对作为实验组,HBV标志物均为阴性孕妇及其新生儿10对作为对照组.采用巢式聚合酶链反应（PCR）法检测血清及PBMC HBVDNA,半巢式PCR检测新生儿PBMC中来自母亲的细胞.结果实验组30例新生儿中,血清HBV DNA阳性4例,PBMC HBV DNA阳性8例,均为弱阳性.8例PBMC HBV DNA阳性新生儿中,4例人类谷胱甘肽S转移酶（GST）M1基因阳性,其中5例母亲的GSTM1基因阳性;3例新生儿GSTM1阴性,母亲GSTM1阳性,在这3例新生儿PBMC中均检测到GSTM1基因.对照组10例新生儿血清和PBMC HBV DNA均阴性.结论 HBV感染新生儿的部分外周血单个核细胞可能来自母体,并作为HBV宫内感染的媒介.     

改良PCR法检测外周血单个核细胞中的HBV DNA与HBVcccDNA

目的检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中HBV DNA的存在状况。方法采用改良PCR法检测慢性HBV感染者PBMCs中HBV DNA、共价闭合环状DNA(cccDNA)。结果120例慢性HBV感染者PBMCs中HBV DNA、cccDNA阳性检出率分别为62.50%、45.83%,HBV DNA阳性检出率高于cccDNA(P<0.01);其中HBeAg阳性组PBMCs中HBV DNA(80.00%)和cccDNA阳性检出率(45.00%)分别明显高于HBeAg阴性组(61.67%)(30.00%)(P均<0.01);PBMCs中HBVDNA检测阳性者血清HBVDNA水平明显高于HBVDNA检测阴性者(P<0.01)。结论改良PCR法检测表明HBV DNA不仅可感染PBMCs,且部分参与复制;PBMCs中HBVDNA存在和复制能力与HBeAg阳性相关;PBMCs中HBV DNA阳性检出率与血清HBV DNA水平有一致性。     

肝移植患者外周血单个核细胞中HBV DNA检测及临床意义

目的研究乙型肝炎肝硬化终末期患者肝移植后外周血单个核细胞(PBMC)HBV DNA状态及临床意义.方法应用荧光PCR技术检测乙型肝炎肝硬化终末期肝移植术后30例患者血清及PBMC标本HBV DNA,并用细胞计数法和管家基因β-actin标定PBMC HBV DNA,观察PBMC HBV DNA与血清HBV DNA定量关系;观察患者肝移植术后不同时间PBMC HBV DNA水平.30例对照组为肝炎肝硬化失代偿期患者.结果移植后患者19份(63%)PBMC标本HBVDNA阳性,低于对照组(87%,26/30).以Ct值为定量参数,移植后患者PBMC HBV DNA水平显著低于对照组(P=0.02);肝移植术后患者PBMC HBV DNA长期维持于103～104拷贝/106细胞水平,与肝移植后时间无明显关系.移植后患者血清HBV DNA均阴性,而对照组血清阳性率为48%.结论乙型肝炎肝硬化终末期患者肝移植术后,经有效预防HBV再感染治疗后,虽然血清中不能测出HBV DNA,但PBMC中HBV DNA阳性,这可能成为肝外"病毒池",导致供肝再感染;对移植后患者监测PBMC HBV DNA,可能有助于早期诊断HBV再感染或复发.     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞内HBV RNA、HBV DNA的检测及其与血清HBV DNA的关系

目的:探讨慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)中HBV感染情况及复制状态,以及与血清HBV DNA的关系.方法:应用PCR技术特异性,选择地检测慢乙肝患者PBMC中HBV RNA、HBV DNA,并与血清HBV DNA进行比较.结果:在慢乙肝患者PBMC中能检测出HBV RNA及HBV DNA,阳性率分别为38.78%及77.55%,且两者的检出率有一致性.当PBMC中HBV RNA阳性时,HBV DNA均为阳性(100%),而当HBV DNA阳性时,部分病例可表现为HBV RNA阴性,两者阳性符合率为50%.血清中HBV DNA阳性率为71.42%.PBMC中HBV RNA的阳性率与血清中HBV DNA的阳性符合率为63.33%,血清中HBV DNA与PBMC中HBV DNA阳性符合率为76.32%.结果提示:HBV能感染PBMC,在部分患者存在着活动性复制,这种复制表现为不同于肝细胞内的低水平复制.此外,HBV感染PBMC后也存在着非复制状态,表现为PBMC中HBV DNA阳性,但HBV RNA阴性.另外,当血中HBV DNA阴性时,少数病例PBMC仍可表现为HBV RNA及HBV DNA阳性.结论:HBV能够感染PBMC并存在活动性复制,可能是造成患者免疫功能紊乱、肝脏损害慢性化的重要原因之一.     

乙肝患者外周血单个核细胞中乙肝病毒复制中间体RNA与乙肝病毒DNA相关性的研究

采用逆转录－多聚酶链反应（RT－PCR）技术检测乙肝患者外周血单个核细胞（PBMCs）乙肝病毒复制中间体RNA（HBV RNA）,60例乙肝患者5例PBMCs中HBV RNA阳性,26例PBMCs中HBV DNA阳性,27例血清HBVDNA阳性;PBMCs HBVDNA 阳性患者中有4例PBMCs HBV RNA阳性,血清HBV DNA阳性患者中有3例PBMCs HBVRNA阳性;17例血清HBeAg阳性患者中有4例PBMCs HBV RNA阳性。血清HBeAg、HBV DNA及PBMCs中HBV DNA阴性患者,其PBMCs HBV RNA仍可能阳性,其PBMCs可成为乙肝患者肝病复发和传播的来源。     

荧光定量检测HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者中的应用

目的:研究慢性乙型肝炎患者HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)在外周血的分布、肝组织中含量及探讨抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA的影响。方法:随机选取HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者、重型肝炎患者共125例。使用实时荧光定量PCR法检测血清中cccDNA。选取36例慢性乙型肝炎患者肝组织和外周血样本,酶切后进行荧光定量PCR检测。60例慢性乙型肝炎患者,按1:1随机分配接受拉米夫定或干扰素治疗,所有患者均治疗24周以上;应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测慢性乙型肝炎患者0周、8周、12周、24周、HBV cccDNA及HBV DNA含量。结果:125例患者中cccDNA阳性率为71.2%,以肝硬化患者阳性率最低。肝硬化患者HBVcccDNA检出阳性率与慢性乙型肝炎患者及重型肝炎患者比较,差异有显著性意义(P0.05)。肝组织中HBV cccDNA与肝组织总HBV DNA及血清HBV DNA存在相关性(P0.05),HBeAg阳性组与阴性组患者比较差异有显著性意义(P0.05)。患者接受抗病毒治疗后血清HBV DNA及HBV cccDNA下降。结论:乙型肝炎肝硬化患者外周血HBV cccDNA阳性率低,慢性乙型肝炎患者中HBeAg(+)组病毒复制较HBeAg(-)组活跃。抗病毒治疗对血清HBV cccDNA有抑制作用;血清HBV cccDNA可作为抗病毒治疗的重要监测指标。     

胎盘滋养层细胞的乙型肝炎病毒感染与宫内感染机制

目的：检测HBV对胎盘、胎肝和滋养层细胞的感染情况，探讨HBV的宫内感染机制。方法：研究对象包括20例孕妇胎盘组织、6例引产胎儿胎肝组织及体外培养的胎盘滋养层细胞。ELISA法检测孕妇外周血、胎儿脐血和6个月婴儿外周血HBV标志物；荧光定量PCR法检测血清和滋养层细胞中的HBV DNA；免疫组织化学法和免疫荧光法检测胎盘、胎肝组织及滋养层细胞中HBV标志物的表达；末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口标记法（TUNEL）检测胎盘和滋养层细胞凋亡情况。结果：孕妇血清HBV DNA水平与胎儿脐血HBV DNA水平相关，脐血HBV DNA阳性者其母血HBV DNA〉1.0×10^7拷贝／mL；6例胎盘组织和3例引产胎儿胎肝组织中可见HBsAg免疫组织化学染色阳性细胞，其中1例胎肝组织中发现HBcAg阳性细胞；体外培养滋养层细胞与HBV DNA阳性血清共孵育后，可检测到HBsAg的表达，亦可检测到HBV DNA。体内和体外实验均检测到HBV感染后滋养层细胞凋亡呈增加趋势，且胎盘细胞的凋亡与脐血HBV DNA水平相关。体外实验结果显示，随感染时间的延长，滋养层细胞凋亡呈增加趋势。6个月后，12例新生儿有1例血清HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性，6例抗-HBs阳性。结论：HBV宫内感染的机制可能是通过HBV感染胎盘屏障而使胎儿发生HBV宫内感染。HBV在胎儿组织器官内的定位和复制可能是新生儿发生慢性HBV感染的重要因素。滋养层细胞凋亡可能是胎盘屏障阻断HBV宫内传播的一种保护性机制。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBV cccDNA定量检测

目的优化HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)特异性定量检测方法,并观察HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况。方法标本抽提核酸后,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,再以跨双缺口的特异性引物进行荧光PCR定量检测HBV cccDNA;用10份HBV高滴度(10~7拷贝/mL)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证此检测方法的特异度和灵敏度;取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝组织穿刺标本各50份,检测其总HBV DNA和cccDNA。结果10份血清标本均无假阳性cccDNA检测结果,灵敏度可达到10~3拷贝/mL。所有PBMC中cccDNA检测均阴性;所有肝组织中总HBV DNA和cccDNA检测均阳性,总HBV DNA含量为3．19×10~2～6．69×10~7拷贝/μg人基因组DNA,cccDNA含量为7．32×10~0～6．51×10~6拷贝/μg人基因组DNA,同一患者肝组织中总HBV DNA含量是cccDNA含量的10．7倍至9．2×10~5倍。结论本方法特异度和灵敏度高。PBMC不能支持HBV的复制。在慢性乙型肝炎患者的肝组织中均可检测到cccDNA,但其水平并非与细胞内总HBV DNA水平正相关。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV复制标志物与肝组织HBsAg和HBcAg抗原表达的相关性研究

目的探讨血清HBV复制标志物与肝组织HBsAg和HBcAg抗原表达的相关性。方法用免疫组化法检测肝组织HBsAg、HBcAg,与血清HBeAg和/或HBV DNA进行相关性比较。结果血清HBeAg阳性与阴性组中肝组织HBsAg阳性率无显著性差异,而血清HBeAg阳性者肝组织HBcAg阳性率显著高于HBeAg阴性者;血清HBV DNA阳性与阴性组中肝组织HBsAg阳性率无显著性差异,但血清HBV DNA阳性者肝组织HBcAg阳性率显著高于HBV DNA阴性者。结论血清HBeAg和HBV DNA水平与肝组织HBcAg阳性率呈正相关。     

死胎肝脏组织中HBV DNA表达的初步探讨

目的　观察死胎肝脏组织中HBVDNA表达的情况 ,探讨通过产妇传播到死胎肝脏组织中的HBV是否存在复制。方法　采集 40例乙型肝炎产妇产下的死胎 ,常规尸检 ,取肝脏组织。采用原位分子杂交法 ,检测其中的HBVDNA ,回访产妇产前静脉血HBV的检测结果。结果　死胎肝脏组织中HBVDNA的检出率为 87 5 % (3 5 /4 0 )。产妇产前静脉血HBV呈高、低和无复制状态时 ,肝脏组织中HBVDNA的检出率分别为 75 0 % (3 /4 )、85 0 % (17/2 0 )和 94 0 % (15 /16) ;高、低、无复制者之间相互比较 ,差异不显著 (P >0 0 5 )。HBVDNA颗粒分布在肝细胞浆内、毛细胆管上皮和管腔内 ,少数分布在肝细胞核上。结论　死胎肝脏组织中有HBV复制 ,死胎肝脏组织中的HBVDNA表达与产妇血清中HBV复制状态无关。     

肝炎肝硬化患者肝组织中HBcAg、HBVDNA表达的初步探讨

观察乙型肝炎引起的肝炎肝硬化患者组织中HBcAg和HBVDNA的表达。随机采取100例乙型肝炎 肝硬化患者，行肝活检术取肝组织，采用免疫组织化学和原位分子杂交，检测其中HBcAg和HBVDNA。肝组织中HBcAg、HBVDNA的检出率分别为64％和62％（P＞0．05）。血清HBV呈高复制时，肝组织中HBcAg和HBVDNA的阳性表达，有较好的一致性；HBcAg颗粒在肝呈弥漫的浆、膜型分布者，其肝组织中HBVDNSA呈高表达，其肝组织病变是活动的（P＜0．05）。乙型肝炎肝硬化患者肝组织中有较高的HBV复制率；肝组织中HBcAg和HBVDNA的分布类型与其中的HBV复制状况和组织病变的活动性有关。     

State of hepatitis B viral DNA in the liver of patients with hepatocellular carcinoma and chronic liver disease

In order to clarify the relationship between the integration of hepatitis B virus (HBV) DNA and human hepatocellular carcinoma (HCC), the states of HBV DNA in liver tissues were examined by the Southern blot hybridization procedure. Integration of HBV DNA was found in 12 of 25 HCC cases and 5 of 12 cirrhotic cases. Of these 17 cases, 11 were positive for serum hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and the remaining six were positive for more than one of the serum HBV-related antibodies. In all three cases of chronic hepatitis and 18 controls, integration of HBV DNA could not be detected. Free viral DNA was found in 12 of 15 cases with serum HBsAg. One patient without serum HBsAg also had free viral DNA in the liver. Integration of HBV DNA could be observed in HCC cases positive for serum HBsAg at the highest frequency. However, there was one HCC case from an HBsAg carrier in whom integration of HBV DNA might not have a causal effect on malignant transformation, because integrated HBV DNA could be detected only in a non-tumor region. Since integrated HBV DNA could not be detected in 13 of 25 HCC cases, other etiologic factors than the integration of HBV DNA must also be taken into consideration for HCC.     

乙型肝炎病毒感染者肝组织IL-12表达及其意义

目的探讨乙型肝炎病毒感染者肝组织白细胞介素12（IL-12）表达与临床表现和肝脏病理学变化的关系。方法应用免疫组化法检测9例正常肝脏组织、183例慢性乙型肝炎（CHB）、41例乙型肝炎肝硬化、37例HBV相关肝癌患者肝组织IL-12表达情况,并与临床特点和病理分级等进行相关性分析。结果 CHB患者肝组织IL-12以弱阳性表达为主,阳性和强阳性表达的比例仅为26.8%,而肝硬化和肝癌患者阳性和强阳性表达的比例分别为36.6%和48.6%,均显著高于CHB患者（P＜0.05）;HBeAg阴转且HBV DNA阴转的CHB患者肝内IL-12阳性表达比例为64.3%,显著高于HBeAg阳性伴肝功能异常者（30.0%）和肝功能正常者（20.4%）（P＜0.05）;未发现IL-12表达与肝脏炎症分级或纤维化分期具有相关性。结论 IL-12可能参与HBV感染后的疾病进展与转归。     

Gremlin-1在原发性肝癌及肝硬化患者中的表达及意义

目的检测Gremlin-1在原发性肝癌及肝硬化患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝脏组织中的表达。方法收集2012年6-12月在第四军医大学唐都医院就诊的21例原发性肝癌及17例肝硬化患者血样,15名健康志愿者作为对照。采用RT-PCR技术检测PBMC中Gremlin-1的表达;免疫组织化学方法检测10例原发性肝癌肝组织中Gremlin-1的表达。组间比较采用ANOVA方差分析。结果 Gremlin-1在原发性肝癌及肝硬化患者PBMC中表达显著升高,分别为正常对照的3.5及4.4倍,与正常对照相比差异有统计学意义(P=0.003 4,0.002 6);Gremlin-1在肝癌患者肝组织中高表达,阳性率为72.5%,在正常肝组织中低表达或无表达,阳性率为12.1%,差异有统计学意义(P0.001),Gremlin-1在高分化及低分化肿瘤表达差异无统计学意义(P0.05);免疫组织化学显示Gremlin-1主要表达在肝肿瘤细胞膜及细胞质,部分表达在血管内皮细胞、成纤维细胞等间质细胞。结论Gremlin-1的表达与肝硬化及原发性肝癌密切相关。     

乙型肝炎肝硬化和肝癌患者肝组织HBV复制状态分析

目的了解肝硬化和肝癌患者HBV的复制状态。方法在1982例肝癌和1995例乙型肝炎肝硬化患者,常规检测HBV标记物,并在其中12例患者取得肝组织进行HBVcccDNA检测。结果肝硬化和肝癌患者抗HBe阳性所占比例分别为61.7%和74%(P<0.01);将肝硬化和肝癌患者合并后,血清抗HBe阳性者血清HBVDNA≤103拷贝/毫升者占69.1%,高于HBeAg阳性者的21.6%(P<0.01);抗HBe阳性患者HBV DNA≥107拷贝/毫升者占6.4%,低于HBeAg阳性者的42.0%(P<0.01);HBeAg阳性和抗HBe阳性患者HBV DNA载量分别为6.1lg拷贝/毫升和3.8lg拷贝/毫升(P<0.01);在送检的12例肝组织,HBV DNA均阳性,HBVcccDNA阳性8例。结论肝硬化和肝癌患者抗-HBe阳性比例较高,肝组织HBVcccDNA仍可被检出。     

丁型肝炎患者肝组织HDAg与HBsAg/HBcAg和HBV DNA相关性研究

目的探讨丁型肝炎患者肝组织中HDAg与HBsAg,HBcAg和HBV DNA表达及相关性.方法应用免疫组化双重染色及连续切片技术和原位杂交,检测了79例丁型肝炎患者肝组织HDAg,HBsAg,HBcAg和HBVDNA表达,以52例乙型肝炎作对照.结果丁型肝炎HBsAg,HBcAg检出率为81%,71%,乙型肝炎为94%,92%,两组比较有显著性差异(P＜0.05或0.01).HDAg以肝细胞核表达为主,其次是胞质表达,HBsAg以肝细胞浆表达为主,HDAg和HBsAg表达强度及阳性细胞分布呈一致性,两种抗原的表达程度与肝组织的炎症活动和病理损害相关(P＜0.01).HBcAg以以肝细胞核表达为主,阳性细胞主要呈单个细胞或点状分布,且HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞.HDAg表达强度与HBV DNA表达呈负相关(P＜0.05).结论HDV感染会抑制HBV DNA复制或病毒抗原表达;在HDV致病机制中HDV的直接细胞毒性可能起主要作用,也有HBV的协同作用.     

乙型肝炎病毒宫内感染的传播途径及早期诊断

目的分析羊水、脐带血、母血、胎盘等组织中乙型肝炎病毒标志物(HBV M)及HBV DNA与胎儿感染的关系，探讨HBV母婴传播机制。方法采用微粒子化学发光及核酸扩增杂交梳技术对65例血液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性不同孕龄孕妇的羊水、母血、脐带血进行HBV M和HBV DNA检测，对自然流产胎儿或死亡婴儿的胎盘、肝脏、心脏、肺脏进行免疫组织化学检测。结果65例血液HBsAg阳性，不同孕龄孕妇的羊水中HBsAg阳性率为21．50％，脐带血阳性率为20．00％；母血、羊水．脐带血HBsAg、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、抗-HBc、HBV DNA均阳性者为6．15％；HBsAg、抗-HBc、抗-HBc阳性、HBV DNA阴性者占13．85％。对4例血液、羊水、脐带血HBsAg、HBeAg、抗-HBc、HBV DNA阳性孕妇分娩或自然流产后胎盘、胎儿及死亡婴儿的肝脏、肺脏、心脏进行免疫组织化学检测发现，胎盘各层组织镜下均可见到HBsAg、HBcAg阳性细胞；在肝脏、肺脏组织中可见到HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)阳性细胞，心肌组织内未见有HBsAg、HBcAg阳性细胞。结论胎儿感染HBV与羊水、胎盘中的病毒相平行；HBV在宫内可感染胎儿血液、肝脏、肺脏等组织；羊水检测HBV M及HBV DNA可作为胎儿早期HBV感染的诊断依据之一。