不耐热肠霉素和耐热肠毒素基因的融合

用重组基因技术将产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的耐热肠毒素（ＳＴａ）基因与不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴ－Ｂ）基因融合。表达的ＬＴ－Ｂ／ＳＴａ融合蛋白，既有ＬＴ－Ｂ的抗原性又有ＳＴａ的抗原性。由于基因融合的方式不同，对ＳＴａ的抗原性影响很大，但对ＬＴ－Ｂ的抗原性没有影响。ＬＴ－Ｂ／ＳＴａ融合多肽保留了ＥＴＥＣ肠毒素结合ＧＭ－１神经节甙酯的能力，却仍具有ＳＴａ的生物毒性。     

不耐热肠毒素和耐热肠毒素基因的融合

用重组基因技术将产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的耐热肠毒素（ＳＴａ）基因与不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴ－Ｂ）基因融合。表达的ＬＴＢ／ＳＴａ融合蛋白，既有ＬＴ－Ｂ的抗原性又有ＳＴａ的抗原性。由于基因融合的方式不同，对ＳＴａ的抗原性影响很大，但对ＬＴ－Ｂ的抗原性没有影响。ＬＴ－Ｂ／ＳＴａ融合多肽保留了ＥＴＥｃ肠毒素结合ＧＭ－１神经节甙酯的能力，却仍具有ＳＴａ的生物毒性。     

产毒性大肠杆菌肠毒素对及豚鼠回肠上皮细胞的影响

产毒性大肠杆菌 (ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ,ＥＴＥＣ)是引起人和家畜急性腹泻病的主要病原菌之一[1] 。ＥＴＥＣ的致病主要与肠毒素有关。它能产生两类肠毒素 :不耐热肠毒素(ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ,ＬＴ)和耐热肠毒素 (ｈｅａｔ ｓｔａｂｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ,ＳＴ)。为进一步探讨ＥＴＥＣ肠毒素的作用机制 ,本研究观察了ＬＴ和ＳＴ对豚鼠离体回肠上皮细胞的影响。1　材料与方法1 1　豚鼠 :为非纯种短毛白色豚鼠 ,体重 35 0～ 45 0ｇ ,雌雄不限 ,由本校动物所提供。1 2…     

LT质粒的新法提取及无毒突变体LTS63K的构建和序列分析

目的：获取野生型产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）基因、构建LTS63K突变体并进行序列分析。方法：用改进的细菌基因组提取含野生型LT基因质粒，用PCR技术扩增LT的DNA，并亚克隆至pMD18-T中进行点突变和序列分析。结果：从野生型大肠杆菌提取大质粒的新法可行，所克隆的LT基因与GenBank公布的完全一致，点突变正确。结论：所克隆的基因和突变基因可用于重组表达和 免疫佐剂的相关研究。     

肠产毒性大肠埃希菌定植因子研究进展

肠产毒性大肠埃希菌定植因子为近几年发现的一种重要的细菌致病菌毛,它能使大肠杆菌粘附于宿主肠牯膜而不被肠蠕动和肠分泌液所清除,再通过其分泌肠毒素导致婴幼儿和旅行者腹泻。菌毛亚单位的保守区域、抗原决定簇组成、定植因子质粒与毒力编码基因的联系,对研制广谱重组菌毛疫苗具有重要指导意义。本文综述了近几年来有关定植因子菌毛的研究进展,以及与各类肠毒素编码质粒的相关性和疫苗研究概况。     

PCR扩增试验快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A～E型基因的研究

ＰＣＲ扩增试验快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ～Ｅ型基因的研究雷祚荣郑玉玲姜结根金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）能分泌２０多种毒性蛋白质，这些毒性物质是引起人类疾病的主要致病因子，其中最主要的一种是葡萄球菌肠毒素（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｎｔｅｒｏｔ...     

粘膜免疫佐剂：肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)研究进展

粘膜免疫佐剂活性是肠产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的重要生物学特性之一。除野生型LT外,LT突变体如LTE112K、LTG33D等及重组体rLTB均具有很强的粘膜免疫佐剂活性;同时后者具有毒性较低的特点,显示了良好的临床应用研究前景。本文对LTs作为粘膜免疫佐剂的作用机制及应用研究近况作了简要的回顾。     

透皮免疫佐剂LTB及LTK63的表达与鉴定

目的 研究新型的透皮免疫佐剂。方法 从大肠埃希菌E．coli H10407中扩增出大肠埃希菌不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）全长基因，并用基因工程的方法表达出了无毒性的A亚单位蛋白LTKA及B亚单位蛋白LTB。将表达产物纯化后用SDS-PAGE、GMI-ELISA等方法进行鉴定。结果 表达的LTB亚单位仍具有和神经节苷脂GMI特异结合的生物学活性，LTK63已经不具有毒素活性。结论 LTB和LTK63有希望成为候选的透皮免疫佐剂。     

产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的检测及其耐药表 …

目的 研究临床分离的产超广谱β内酰胺酶（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ β ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ＥＳＢＬｓ）大肠杆菌对常用抗生素的耐药性及其基因类型。方法应用双纸扩散法及Ｅ ｔｅｓｔ检测ＥＳＢＬｓ；微量稀释法测定产ＥＳＢＬｓ大肠杆菌对临床常用抗生素的耐药性；全自动核型分析和脉冲场凝胶电泳（ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）研究产ＥＳＢＬｓ大肠杆菌的基因型。结果     

幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）和尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的重组蛋的白质的侯选菌株。方法 用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色休ＤＮＡ上分别扩增出ＨｓｐＡ和ＵｒｅＢ基因片段,将它们融合插入原核表达载体ｐＥＴ－２３ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。结果 经测序,ＨｓｐＡ－ＵｒｅＢ（ＨＵ）事例基因片段由２０６１ｂｐ组成,为编码６８７个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳ－     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的　对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法　应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果　PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论　所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的基因引入pET22b( )并转化E．coli BL21(DE3)；重组工程菌在改良M9-CAA培养基内进行表达；对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂(GMl)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达，两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET22b( )质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。     

重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系。接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病最为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市。Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA6 3)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用。本文检测了本实验室研制的重组UreB(rUreB)和HpaA(rHpaA)的免疫反应性和抗原性、重组LTB(rLTB)和CTB(rCTB)的佐剂活性,以Hp…     

霍乱毒素佐剂应用研究进展

霍乱毒素（CT）是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,具有很强的免疫原性和佐剂活性。CT本身有很强的毒副作用,如何既能具备优良的佐剂活性而又没有明显的毒副作用是当前研究的主要目标。CT及其亚单位因其独特的生理功能已被广泛地应用到很多新的免疫与疫苗策略中,已成为当前重要的佐剂之一。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的：获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位（HspA）的融合蛋白。方法：PCR扩增ltB和hspA基因，依次构建至表达载体pIM-1，转化大肠杆菌，SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性。结果：重组LTB-HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的25％。免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白。GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性。结论：LTB-HspA融合蛋白的表达研究，为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础。     

产毒性大肠杆菌菌毛F_(41)抗原单克隆抗体及其免疫学特性的鉴定

产毒性大肠杆菌(ETEC)是婴儿和幼畜急性腹泻的重要病原之一,其致病因子主要有肠毒素和定居因子(又称粘附素)。现已证明,菌毛抗原是介导ETEC粘附肠上皮细胞的定居因子,是该菌感染的第一步,也是人们注目的预防该菌感染的菌毛疫苗组分。F_(41)菌毛抗原是近年来才发现的畜源性ETEC的一种新的定居因子。因此,F_(41)菌毛抗原单克隆抗体及其     

人淋巴毒素cDNA在大肠杆菌表达的研究

目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素ｃＤＮＡ。方法：将本室克隆的人淋巴毒素ｃＤＮＡ亚克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０,温控法诱导重组菌,ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测和鉴定结果,ＭＴＴ比色法测定重组ＬＴ活性。结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白;重组蛋白占细菌总蛋白的１２％,并具有细胞毒活性,活性单位相当于２×１０５Ｕ／Ｌ菌液。结论：为重组ＬＴ的大量生产、临床应用,为进一步研究人ＬＴ的生物学功能奠定了基础。     

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因（entD），表达和纯化其重组蛋白（rSED），以进一步制备抗rSED抗体，研制SED金标免疫快速检测试纸条。方法利用PCR技术．从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株，扩增entD基因，克隆至pGEM—T Easy载体．亚克隆至原核表达载体pET28a，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达蛋白，Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，免疫印迹检测抗原活性。结果分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株．成功克隆entD序列．测序表明该基因共684bp，与其他entD序列（GenBank登陆号：M28521）具有99％的同源性。rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。免疫印迹结果表明．rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别。结论通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性。     

应用非放射性标记探针测定小肠结肠炎耶氏菌新亚型耐热肠毒素

由致病性小肠结肠炎耶氏菌产生的耐热肠毒素（Ｙ－ＳＴ）至少有三个亚型（Ｙ－ＳＴａ，Ｙ－ＳＴｂ，Ｙ－ＳＴｃ），但以Ｙ－ＳＴａ型多见。我们构建了０．２５ｋｂ的Ｙ－ＳＴａＤＮＡ克隆片段，经用辣根过氧化酶标记后，具特异性。１９株我国分离的致病性小肠结肠炎耶氏菌由乳鼠试验结果显示均可产生Ｙ－ＳＴ。但用此酶标记Ｙ－ＳＴａＤＮＡ探针测定，仅１３株呈杂交反应，表明携带Ｙ－ＳＴａ基因；其余６株均为阴性反应，免疫学试验显示１株产生Ｙ－ＳＴｂ，另外５株产Ｙ－ＳＴｃ。产生耐热肠毒素的大肠杆菌及非０１霍乱弧菌等也不与此探针杂交。     

抗大肠杆菌J5株脂多糖单克隆抗体免疫保护作用的实验研究

本文以大肠杆菌感染小鼠的动物模型，对我们制备的两株抗大肠杆菌Ｊ５株脂多糖单克隆抗体（ＥＬ１和ＥＬ３）免疫保护效果进行了研究．结果表明：（１）ＥＬ１和ＥＬ３均有明显提高受５ＬＤ５０大肠杆菌感染小鼠存活率的作用（Ｐ＜０．０１）；（２）ＥＬ１和ＥＬ３注射时间对其免疫保护效果有较大的影响；（３）ＥＬ１和ＥＬ３可明显延长受大剂量大肠杆菌（１０ＬＤ５０）感染小鼠的平均存活时间．提示ＥＬ１和ＥＬ３具有中和大肠杆菌ＬＰＳ，从而降低其毒性的作用。