溶血磷脂酸对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 :探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞 (RPE)方法。方法 :取自愿者贡献的意外事故成年眼球 ,用 0 .2 5 %胰酶消化获取人RPE细胞、置 15 %胎牛血清的DMEM培养液中培养 ,细胞接近融合状态时进行传代培养。用溶血磷脂酸 (lysophosphatidicacid ,LPA)观察RPE增殖的影响。结果 :RPE原代细胞镜下为圆形 ,大小不一 ,内含较多的色素颗粒 ,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后第 3天增殖速度明显加快 ,至 4～ 5d即可基本融合 ,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第 3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛 ,细胞质内细胞器丰富 ,线粒体量多 ,体积较小 ,内外膜分界清晰 ,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内 ,多数细胞质内含量较少 ,呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。结论 :LPA可促进人类RPE细胞体外培养的增殖 ,第 3代培养的视网膜色素上皮细胞可保留原代细胞的生物学特性     

人类视网膜色素上皮细胞体外培养的转分化

目的:研究人类视网膜色素上皮细胞(human retinal pig-ment epithelium,HRPE)体外培养的转分化现象。方法:倒置显微镜观察体外培养HRPE细胞形态变化;采用免疫细胞化学染色方法检测HRPE细胞角蛋白及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化。结果:HRPE细胞体外培养时形态由上皮细胞特征变化成为间质样细胞;细胞角蛋白表达与传代代数呈负相关(r=-0.831,P<0.001),α-SMA表达与传代代数呈正相关(r=0.456,P=0.002);角蛋白18表达高密度组较低密度组强(t=2.591,P=0.027);而α-SMA表达高密度组较低密度组弱(t=2.938,P=0.015)。结论:HRPE细胞体外培养转分化主要是体内外环境差异引起。     

体外原代培养人视网膜色素上皮细胞

目的：探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术。为研究溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法：取自愿贡献的意外事故成年眼球，用2．5g／L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL／L胎牛血清的DMEM培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。取自愿贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞，用DMEM加100mL／L血清及MEM氨基酸和庆大霉素，进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF—β2)及LPA TGF—β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验，用细胞染色法进行细胞计数，提取视网膜色素上皮细胞DNA，用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果：RPE原代细胞镜下为圆形，大小不一，内含较多的色素颗粒，胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快，至4～5d即可基本融合，细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛，细胞质内细胞器丰富，线粒体量多，体积较小，内外膜分界清晰，嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内，多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。含有和／或缺乏10mL／L小牛血清的两种LPA(10μmol／L)均明显刺激视网膜色素上皮细胞增殖，但这种细胞的增殖被TGF-β2所抑制，LPA(10μmol／L)引起视网膜的色素上皮细胞DNA合成增加是正常对照组的两倍。     

视网膜色素上皮细胞移植的研究

视网膜色素上皮 (retinal pigm ent epithelium,RPE)由排列规则的单层细胞构成 ,位于视网膜神经上皮层和 Bruch膜之间 ,由于其特殊的解剖学位置 ,它在视网膜中起着重要的作用 [1 ]。 RPE、Bruch膜和脉络膜毛细血管的进行性病变可危及视网膜感光细胞 ,形成视网膜下的新生血管膜 ,比如老年黄斑变性 (age- related macular degeneration,ARMD)。传统的光凝疗法预后不佳 ,尤其在黄斑区 [2 ,3] 。近年来成功开展了视网膜下膜的“剥膜”手术 ,由于同时丧失了 RPE细胞 ,要求移植以作补充。由此带来了以下新课题 :(1) RPE的取材与培养 ;(2 )…     

HSV-1感染对人视网膜色素上皮细胞生长的影响

目的:建立单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus,HSV-1)感染人视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmentepith elial,RPE)的体外模型,观察HSV-1感染对体外培养RPE细胞生长的影响。方法:以感染复数(MOI)为5的HSV-1(F株)感染体外培养的RPE细胞。用相差显微镜观察RPE细胞的形态变化;用MTT法、流式细胞术观察HSV-1感染对RPE细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;用PCR和免疫荧光法验证HSV-1感染RPE细胞是否成功。结果:成功在体外建立了HSV-1感染RPE的细胞模型。HSV-1感染RPE细胞8h后出现病变,细胞形态开始变得细长和皱缩;感染24h后细胞病变更加明显,细胞间间隙增加,甚至可见多核巨细胞;感染48h后所有细胞均变圆,细胞开始出现脱落甚至死亡。MTT法显示HSV-1感染RPE后24h和48h能抑制细胞生长(P<0.01),细胞的抑制率分别为(16.37±3.28)%和(47.91±6.39)%;流式细胞仪检测发现HSV-1感染可影响RPE细胞的细胞周期,但对细胞凋亡无明显影响。结论:HSV-1能感染体外培养的RPE细胞,抑制RPE细胞的增殖,并影响RPE细胞的细胞周期。眼科学报2007;23:212-218.     

电场对人视网膜色素上皮细胞生物学活性的影响

目的:观察电场作用对培养人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelial,hRPE)细胞活力及分裂过程的影响。方法:hRPE细胞置于强度为8V/cm的直流电场中暴露3h,停止电场作用后继续培养12h;未受电场作用的hRPE细胞作为对照组。显微摄像系统记录各时间点细胞图像,观察细胞形态变化;细胞行台盼蓝拒染活细胞计数及核仁嗜银蛋白(AgNORs)染色,图像分析染色结果;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:暴露于电场中的hRPE细胞伸长,垂直于场线方向排列,停止暴露后细胞恢复正常形态及分布;各时间点实验组与对照组细胞的台盼蓝拒染率差异无统计学意义(P>0.05);电场暴露前、暴露3h及停止暴露并继续培养12h后hRPE细胞核内AgNORs颗粒数分别为:6.2,6.5,7.3,与正常对照组细胞比较均无显著差异(P>0.05);流式细胞仪检测结果显示各组均未见明显细胞凋亡。结论:短时间电场作用对hRPE细胞的正常细胞活力及分裂无明显影响,提示该条件下的电场作用可能应用于促进RPE细胞修复的研究。     

二甲基亚砜对培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的　探讨细胞分化诱导剂及端粒酶抑制剂二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用。方法　本研究分实验组和对照组 ,对照组弃原培养液 ,加无血清培养液继续培养 ,实验组用不同浓度的DMSO 5、10、2 0、4 0mL·L-1分别作用于人RPE细胞 2 4、4 8、72、96h ,用MTT法检测DMSO对hRPE细胞生长的影响 ,流式细胞仪检测DMSO对hRPE细胞周期的影响。结果　 10mL·L-1DMSO处理的hRPE细胞从作用 4 8h开始 ,OD值 ( 0 .5 37± 0 .0 10 )小于对照组 ( 0 .6 4 7± 0 .0 2 2 ) ,有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,细胞生长受到抑制 ,且随浓度增加及作用时间延长 ,抑制越显著。流式细胞仪检测 2 0mL·L-1DMSO作用 72h细胞周期发生明显变化 ,G1期细胞由4 1 31%增加至 5 9.6 5 % ,S期由 32 .0 9%减至 2 1.2 1% ,G2 期由 2 6 .6 5 %减至 19 14 % ,细胞生长被阻滞在G1期 ,生长受到抑制。结论　DMSO能阻滞hRPE细胞于G1期 ,抑制hRPE细胞增殖且呈剂量依赖性。     

兔视网膜色素上皮细胞的体外标记

目的 建立兔视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞的体外标记方法。方法 兔ＲＰＥ细胞经传代培养并鉴定后,掺入溴脱氧嘧啶（ＢｒｄＵ）对细胞进行体外标记,通过免疫组织化学方法来显示标记的细胞。结果 ＢｒｄＵ标记后,所有的细胞核呈阳性染色。结论 提供一种简便易行的ＲＰＥ细胞标记方法,提示ＢｒｄＵ掺入法适用于所有培养细胞的体外标记。     

神经生长因子对人胚胎视网膜色素上皮细胞生长及其DNA合成的影响

目的　探讨神经生长因子 (NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (RPE)细胞的促增殖作用及DNA合成的影响。方法　分别用MTT法测定加入NGF 10 0、2 0 0、30 0 μg/L 48h后人RPE细胞数量的改变和核酸蛋白分析仪测定加入NGF 5 0、10 0、2 0 0、30 0、40 0 μg/L 48h后人RPE细胞DNA质量浓度的变化。 结果　 10 0、2 0 0、30 0 μg/LNGF作用 48h后其细胞增殖的A值分别为 ( 0 2 137± 0 0 2 33)、( 0 2 188± 0 0 181)、( 0 2 32 2± 0 0 16 4) ,与对照组 ( 0 1897± 0 0 15 2 )相比 ,差异有显著性 (q test ,P <0 0 5 ) ;10 0、2 0 0、30 0、40 0 μg/LNGF作用 48h后其细胞DNA质量浓度分别为 ( 981 2 2 0 4± 12 3 5 35 7)、( 1375 8484± 2 44 4 718)、( 16 5 8 70 71± 176 9381)、( 2 35 3 0 86 3± 6 0 9 90 6 4) μg/ml ,与对照组 ( 6 6 6 8188± 14 1 330 2 ) μg/ml相比差异有显著性 (q test,P <0 0 5 )。结论　NGF可促进人RPE细胞增殖及促进细胞DNA合成。     

褪黑素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的观察褪黑素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞生长、增殖的影响,寻找药物以防治增殖性玻璃体视网膜病变。方法分别将不同浓度的褪黑素(0,125ng·L-1,250ng·L-1,500ng·L-1)加入体外培养的视网膜色素上皮细胞培养液,72h后用四甲基唑盐(MTT)比色法在自动酶标测定仪测540nm处的吸光值A,并计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率。结果褪黑素在不同浓度下抑制视网膜色素上皮细胞增殖,并存在剂量-效应关系,实验组125ng·L-1和500ng·L-1组与对照组比较有显著性差异(P<0.001),但实验组250ng·L-1组与对照组之间的差异无显著性。结论褪黑素能抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖,可作为防治增生性玻璃体视网膜疾病的侯选药物作进一步研究。     

机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞增生和移行的影响

目的视网膜脱离和眼内增生性病变形成时,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞层可能会受到牵拉力的作用。本实验旨在观察培养人RPE细胞在受机械牵拉力时增生和移行的变化。方法将胶原包被的磁珠悬液加入培养人RPE细胞后孵育,附着磁珠的细胞放置在恒定磁场中,分别于不同时间点用MTT比色实验和3H-TdR掺入试验检测细胞的增生情况,用融合单层培养RPE细胞部分缺失模型观察细胞移行变化。此外,观察去炎松对机械牵拉条件下RPE细胞增生和移行的影响。结果机械牵拉在急性期促进了RPE细胞的增生和移行。去炎松呈剂量依赖性抑制这一作用。在机械牵拉作用下15min和30min时的增生促进率分别为15.72%±0.46%(P=0.037)、24.80%±0.23%(P=0.003)。机械牵拉作用下30min时,移行促进率为23.67%±2.53%(P:0.031)。结论机械牵拉能促进RPE细胞的增生和移行,这一过程可能参与视网膜脱离或眼内增生性疾病的发生。     

电场对人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的观察一定条件下电场对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epitheli-um,hRPE)细胞增生的影响及相关机制。方法hRPE细胞置于电场强度为6V.cm-1的电场中连续作用12h。观察未受电场作用的正常对照组及电场作用12h的实验组细胞,显微摄像系统记录不同时间点细胞图像并计数细胞数,检测细胞密度和细胞的生长速度,观测指标包括:细胞密度,以每平方厘米细胞数表示;细胞生长速度,计算公式为:(Ni-N0)/N0×100%(Ni为12h细胞数;N0为0h细胞数);采用流式细胞仪测定细胞周期,计算细胞增生指数:(NS+NG2/M)/N(NS为S期细胞数;NG2/M为G2/M期细胞数;N为细胞总数);Western blotting检测细胞cyclinE蛋白的表达。结果对照组hRPE细胞在12h的观察期间内细胞密度缓慢上升,到12h时细胞密度由95×103cm-2增至130×103cm-2;而实验组在6V.cm-1电场作用下hRPE细胞数量逐渐上升,12h后细胞密度上升至150×103cm-2。实验组hRPE细胞生长速度为50.02%,较对照组(36.84%)明显升高(P<0.05);...     

贝伐单抗对视网膜色素上皮细胞抗氧化功能的影响

目的 观察贝伐单抗对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞抗氧化功能的影响,以探讨抗新生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)制剂治疗年龄相关性黄斑变性后黄斑部萎缩的可能机制.方法 用含终浓度0.25g·L-1贝伐单抗的DMED/F12培养液培养人RPE细胞系ARPE-19细胞,根据处理时间的不同分为Oh组(对照组)、12 h组、24 h组、48 h组、72 h组共5组,加入H2O2诱导氧化应激反应.用CCK-8法检测细胞活性,MitoSox Red荧光染色检测细胞内线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生水平,JC-1荧光染色检测细胞线粒体膜电位的变化;分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印迹法(Western blot)检测各组促氧化因子NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)和抗氧化因子血红素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1) mRNA和蛋白的表达水平.结果 CCK-8检测结果显示:上述处理对细胞活性无显著影响,Oh组、12 h组、24h组、48h组和72 h组细胞活性分别为(100.2±3.3)％、(99.2±2.7)％、(102.5±6.4)％、(103.9±3.7)％和(103.6±3.3)％,差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组相比,12 h、24h、48 h、72 h组细胞内ROS水平上升,差异有统计学意义(P＜0.05);线粒体膜电位在12 h、24h、48 h、72 h组均较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.01),48 h达最低,72 h时显著提高,但仍低于对照组.RT-PCR和Western blot检测结果显示:与对照组比较,NOX4 mRNA和蛋白的表达在12 h、24h、48 h和72 h组均上升,而且在24h表达最高,之后明显下降,但仍高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,HO-1 mRNA的表达在24h、48 h和72 h组均下降,而HO-1蛋白的表达在48 h和72 h组下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 临床浓度的贝伐单抗可以降低RPE的抗氧化功能,可能是长期抗VEGF治疗后黄斑部进行性萎缩的原因之一.     

生长因子与视网膜色素上皮细胞

目前 研究认为视网膜色素上皮(RPE)细胞是构成增生性视网膜疾病中增生膜的主要细胞成分。RPE细胞的增生和移行，使得增生组织长人玻璃体内，最终导致牵拉性视网膜脱离和失明。新近研究的某些生长因子在RPE细胞的增生和移行中发挥了重要作用。介绍几种主要的生长因子对RPE细胞的作用，为RPE细胞的实验研究和临床研究提供理论基础。     

蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响和机制研究

目的:研究蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能机制.方法:利用35W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长在470~520nm,光照强度控制为2000Lx左右,光照时间控制为24~96h,利用CCK-8法检测RPE细胞的增殖能力,利用real-time PCR技术检测RPE细胞中miR-103的含量.结果:与对照组相比,蓝光照射组的RPE细胞的增殖能力减弱;蓝光照射组的RPE细胞内的miR-103含量较对照组增加;miR-103过表达时,RPE细胞的增殖能力减退,降低miR-103的表达时,细胞增殖能力增强;降低miR-103的表达能够减弱蓝光对RPE细胞增殖的抑制作用.结论:蓝光通过上调miR-103抑制RPE细胞的增殖,miR-103可能成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病治疗的新靶点.     

贝伐单抗对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖及纤维化的影响

目的：观察贝伐单抗对体外培养的人视网膜色素上皮细胞ARPE－19增殖及钙黏连蛋白（ E－cadherin ）和纤维连接蛋白（ fibronectin ）表达变化的作用,探讨贝伐单抗对ARPE－19增殖及纤维化的影响。方法：用不同浓度（0、0．625、1．25、2．5、5．0mg／mL）的贝伐单抗干预体外培养人视网膜色素上皮细胞ARPE－19,采用CCK－8法分别于24、48、72 h检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;应用免疫蛋白印迹法（ Western blotting）及逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测ARPE－19中E－cadherin和fibronectin的蛋白及mRNA的表达变化。结果：浓度为2．5、5．0 mg／mL贝伐单抗能有效抑制ARPE－19细胞的增殖及细胞周期,差异有统计学意义（ P＜0.05）。2．5、5．0 mg／mL贝伐单抗能抑制E－cadherin 基因,促进fibronectin基因的转录及表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论：高浓度的贝伐单抗能够抑制ARPE－19细胞的增殖,下调纤维化相关因子E－cadherin ,同时上调fibronectin的表达,提示高浓度的贝伐单抗可以引起ARPE－19细胞纤维化。