抑制ERK增强白血病和卵巢癌耐药细胞系化疗敏感性

为了研究细胞外调节蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases，ERK)和端粒酶在白血病和卵巢癌细胞耐药中的作用，应用流式细胞术检测细胞凋亡率，应用端粒重复序列扩增法(TRAP)和生物发光分析法去除检测端粒酶活性，应用Weestern blot法检测磷酸化ERK1/2蛋白(ERK1和ERK2)表达水平。结果表明：ERK激酶1(MEK1)特异性抑制剂PD98059能增强HL-60／E6细胞对三尖杉酯碱(HRT)的敏感性，PD98059也能增强COCl／DDP细胞对顺铂(DDP)的敏感性。PD98059与化疗药物HRT和DDP均可以降低细胞内磷酸化ERK表达，抑制端粒酶活性，但PD98059与化疗药物的联合作用明显强于其各自的单独作用。结论：通过阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2蛋白表达水平，进而下调端粒酶活性，可以达到增强白血病和卵巢癌耐药细胞对HRT或DDP敏感性的目的。     

白血病和卵巢癌亲代及耐药细胞系细胞外调节蛋白激酶与端粒酶活性的变化

本研究观察白血病和卵巢癌亲代及耐药细胞系中端粒酶活性及细胞外调节蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases ERK)磷酸化蛋白表达水平的变化，探讨端粒酶与ERK在白血病及卵巢癌耐药中的作用。采用MTT法评价白血病和卵巢癌亲代和耐药细胞系对HRT或DDP的敏感性，用流式细胞术分析这两种细胞系间细胞周期分布的差别，用端粒酶重复扩增技术(TRAP)、生物发光分析法定量和定性检测端粒酶活性及用Western blot检测法检测磷酸化ERK1和ERK2蛋白的表达水平。结果表明：白血病和卵巢癌耐药细胞系处于G0／G1期的细胞比例增加，端粒酶活性和磷酸化ERK1/2蛋白表达水平耐药细胞系较亲代细胞系高。结论：耐药细胞系G0／G1期细胞比例增加可能是细胞产生耐药的一种标志。白血病和卵巢癌细胞系耐药的产生可能与端粒酶活性和磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的增高有关。     

甲基莲心碱对长春新碱人抗视网膜母细胞瘤细胞作用的影响及与RB蛋白表达的关系

目的：探讨甲基莲心碱对长春新碱（Vincnstine,VCR)抗人视网膜母细胞（Retinoblastoma,RB)作用的影响及与RB蛋白表达的关系。方法：甲氮甲唑蓝（MTT）法检测药物对肿瘤细胞增殖的影响，流式细胞仪检测RB蛋白的表达，PI染色流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡，结果：（1）5、10umol/L Nef能降低VCR抑制Rb细胞的IC50，（2）5、10umol/L Nef能促进VCR诱导Rb细胞凋亡，（3)10umol/L能促进Rb细胞的RB蛋白的表达，（4）Nef能促进Rb细胞G1阻断。结论：（1）Nef能增加VCR抑制Rb细胞增殖，促进VCR诱导Rb细胞凋亡，具有较好的化疗增敏作用，（2）Net通过促进Rb细胞Rb蛋白的表达和Rb细胞G1阻断，而实现对视网膜母细胞瘤的化疗增敏作用。     

三氧化二砷对NB4及Jurkat细胞系端粒酶活性的抑制效应

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对白血病细胞系NB4及Jurkat细胞端粒酶活性的调节作用和机制，采用MTT、基因组DNA电泳、蛋白／DNA双参数流式细胞术，端粒重复扩增(TRAP)-SYBR Green I染色及RT—PCR等方法研究了As2O3对两种细胞的增殖及端粒酶活性的影响。研究发现，随着As2O3作用时间的延长，NB4及Jurkat细胞增殖明显受到抑制，DNA电泳出现“梯状”条带；流式细胞术检出亚Gl峰，细胞周期阻滞于Gl和G2／M期，端粒酶活性显著降低，部分细胞周期及凋亡相关的调控蛋白的表达发生变化。结论：As2O3在抑制NB4及Jurkat细胞增殖和诱导其凋亡过程中导致端粒酶的活性下调，细胞周期及凋亡相关蛋白的表达改变可能参与了部分作用机制。     

三氧化二砷诱导MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控研究

为了研究三氧化二砷（As2O3）诱导人类骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞过多型（MDS—RAEB）细胞株MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控机制，采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP—ELISA）检测端粒酶活性；RT—PCR法检测端粒酶逆转录酶（hTERT）、TRF1（TTAGGG repeat binding factor 1）、TRF2（TTAGGG repeat binding factor 2）、bcl-2、bax等基因mRNA水平的表达；磷脂酰丝氨酸（PS）转位等方法检测细胞凋亡，结果表明：1—8μmol／L As2O3诱导MUTZ-1细胞凋亡呈时间、浓度依赖关系。在该浓度范围内，As2O3可下调细胞端粒酶活性。且端粒酶活性下调与凋亡细胞阳性率呈明显负相关（r=一0．938，P=0．018）。MUTZ-1细胞经As，01作用后，hTERT基因mRNA表达下调，并与端粒酶活性变化呈正相关（r=0．783，P=0.022），但As2O3对TRF1及TRF2基因mRNA表达没有明显影响.MUTZ-1细胞端粒酶活性受抑制同时，伴有bcl-2 mRNA表达下调及bcl-2／bax比值下降结论：As2O3可能通过抑制细胞端粒酶活性及hTERT表达，诱导MUTZ-1细胞凋亡。As2O3抑制MUTZ-1细胞端粒酶活性可能是诱导该凋亡机制之一。     

低氧模拟剂氯化钴对人单核细胞白血病细胞株SHI-1化疗敏感性的影响

【目的】研究氯化钴（CobaltChloride,CoCl2）模拟的化学性低氧是否能增强人单核细胞白血病细胞株SHI—l细胞对依托泊苷（VP-16）的敏感性,并探讨及其分子机制。【方法】在培养基中加入低氧模拟剂CoCl2（终浓度为100umol／L）模拟化学性低氧环境（低氧组）,并用正常培养基作对照（对照组）。分别在对照组和低氧组中加入不同浓度的VFL16（0．5,1．0,2．0μg／mL）,即VP16组和低氧＋VP-16组。检测各组的细胞的增殖抑制率（四甲基偶氮唑盐法）,细胞凋亡率（流式细胞术）,FAK、AKT、ERK、HIF-1α、Bcl-2及Pax基因mRNA表达（实时定量PCR方法）。【结果】①低氧组SHF-1细胞增殖受到抑制,并随作用时间延长而逐渐增强。②低氧模拟剂CoCl2也可在一定程度上诱导SHI-1细胞凋亡,并对VP-16诱导的SHI-1细胞凋亡有促进作用（P〈0．05）。③低氧模拟剂CoCl2可以增强FAK、AKT、ERK、HIF-1α、Bcb2及Pax基因mRNA表达（P〈0．05）,且Bax／Bcl-2比值升高更为明显。CoCl2并不能使VP-16作用24h后SHF1细胞内FAK、AKT和Beg2基因mRNA表达发生明显变化,但可以使ERK、HIF-1α和PaxmRNA表达量增加（P〈0．05）,且Pax／Bcl-2比值升高。【结论】CoCl2模拟化学性低氧对SHI-1细胞生物学活性有一定的抑制作用并能增强其对VP-16的化疗敏感性,其分子机制可能涉及ERK介导的信号通路对HIF_1a表达的调控作用,以及HIF-1α介导的信号传导通路对Pax和Bcl-2基因表达的不均衡调控。     

二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4的作用及机制探讨

本研究旨在探讨二甲双胍对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞生物学特性的影响及可能的作用机制。采用不同浓度的二甲双胍处理NB4细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过细胞黏附实验分析药物对细胞黏附能力的影响。采用细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化抑制剂U0126预处理NB4细胞,Westernblot观察ERK磷酸化水平的变化,同时检测细胞凋亡和黏附能力的改变。结果表明,二甲双胍能抑制NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡,增强细胞的黏附能力。5μmol／LU0126预处理有效抑制NB4细胞中ERK的磷酸化,降低5mmol／L二甲双胍诱导的细胞凋亡并减弱细胞的黏附能力。结论：二甲双胍对NB4细胞有抑制增殖、促进凋亡和黏附的作用,MEK／ERK信号通路可能是二甲双胍在NB4细胞中的分子作用机制之一。     

蝮蛇毒提取物诱导白血病细胞K562凋亡

本研究探讨皖南蝮蛇毒蛋白提取物对白血病细胞K562增殖的影响及诱导凋亡的作用，采用MTT（四唑氮蓝）法检测不同浓度的蛇毒蛋白提取物对K562细胞生长的影响；应用电子显微镜观察药物作用后K562细胞形态的改变：流式细胞术检测蛋白提取物对K562细胞细胞凋亡作用；Western blot检测细胞增殖酶活性的变化。结果表明：1—20μg/ml蛇毒蛋白提取物明显抑制K562细胞的生长，且对K562细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖的关系；提取物作用48小时后显示明显的细胞毒作用；与对照组相比，蛇毒作用48小时后K562细胞出现典型凋亡特征；1、10、20μg／ml蛇毒作用48小时后的凋亡率分别为21.3％、49、7％、70．1％；蛇毒提取物使ERK活性明显降低。结论：蛇毒蛋白能够抑制K562细胞增殖，诱导其凋亡。     

2-甲氧基雌二醇诱导MUTZ-1细胞凋亡及对端粒酶活性的影响

目的探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）诱导骨髓增生异常综合征（MDS）细胞株MUTZ-1细胞凋亡及其对细胞端粒酶活性表达的影响，以及细胞凋亡和端粒酶活性之间的相关性。方法采用不同浓度的2-ME处理MUTZ-1细胞，用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的改变；用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA）检测细胞端粒酶活性变化。结果1、2和4μmol／L2-ME分别作用MUTZ-1细胞12h，流式细胞术检测出G0／G1期和S期细胞逐渐减少，G2／M期细胞明显增多（P〈0．05），细胞被阻滞于G2／M期；1和2μmol／L 2-ME作用MUTZ-1细胞12h，两组凋亡率均无明显增加（P〉0．05）；1、2和4μmol／L2-ME作用MUTZ-1细胞36h时，凋亡率为（12．87±0．86）％～（21．82±1．71）％，2-ME诱导细胞凋亡具有时间和剂量依赖性；2-ME诱导MUTZ-1细胞凋亡的同时伴随着端粒酶活性下调，且随着2-ME浓度增加和作用时间延长，端粒酶活性抑制作用增强；端粒酶活性下调与G2／M期细胞数呈负相关（r=-0．979，P=0．021），与细胞凋亡率呈负相关（r=-0．970，P=0．030）。结论2-ME诱导MUTZ-1细胞凋亡并抑制其端粒酶活性可能是其抗肿瘤的机制之一。     

端粒酶活性在白血病细胞凋亡中的变化及凋控机制研究

端粒酶是一种核糖核蛋白酶 ,具有维持端粒长度 ,防止染色体端 端融合、重组、丢失或降解 ,延长细胞生存时间的功能。白血病细胞内的高端粒酶活性是保持其永生化的关键。细胞外调节蛋白激酶 (ＥＲＫ)通路与细胞凋亡及细胞恶性表型转变等多种细胞生物学效应有关。我们观察了几种常用化疗药物诱导白血病细胞凋亡时 ,端粒酶活性和ＥＲＫ表达的变化 ,探讨了ＥＲＫ和端粒酶之间的相互关系及其在化疗药物诱导白血病细胞凋亡中的作用。材料和方法1　细胞培养　ＨＬ 6 0和Ｋ5 6 2细胞系均引自中国典型培养物保藏中心。采用含体积分数为 10 %的胎牛血…     

化疗药物与细胞因子协同作用引起小鼠T淋巴瘤细胞凋亡

本实验旨在了解化疗药物和细胞因子协同作用对细胞凋亡的影响。在培养的小鼠Ｔ淋巴瘤ＲＭＡ细胞系中加化疗药物地塞米松（ＤＥＸ）、足叶乙甙（ＶＰ１６）、三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）及维甲酸（ＡＴＲＡ）以及培养细胞中先分别与细胞因子ＩＬ－２,ＩＬ－６和ＧＭ－ＣＳＦ共同培养后再加入上述药物,观察对引起细胞凋亡的影响。四种化疗药均能抑制ＲＭＡ细胞增殖,ＤＥＸ,ＶＰ１６和Ａｓ２Ｏ３可以诱导细胞凋亡,单独使用ＡＴＲＡ不     

黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响研究

目的研究黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响,为临床肝癌的治疗提供科学的参照。方法选取人的SMMC-7721型肝癌细胞,分别在加入500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM、0μM黄连素的培养液中进行体外培养。于0 h、24 h、48 h、72 h时使用MTT方法对细胞活性进行测定,基于统计学处理方法,分析黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响作用。结果黄连素对SMMC-7721人肝癌细胞的生长具有显著的抑制作用,且随着作用时间和作用浓度的增加抑制作用呈上升趋势,但黄连素不会影响SMMC-7721人肝癌细胞的复制增殖周期。结论黄连素对能够显著抑制SMMC-7721人肝癌细胞的生长,并诱导细胞的凋亡,作用程度与作用时间和浓度呈正相关,但对细胞的增殖周期没有影响。     

直流电治疗对人肝癌细胞SMMC7721凋亡的诱导作用

研究电化学治疗对人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１凋亡的诱导作用及其机制,为ＥＣＴ治疗的临床应用提供依据。方法采用体外模型研究ＥＣＴ的效应。以ＡｎｎｅｉｎＶ标记法、ＤＮＡ含量测定、电子显微镜等方法观察了ＥＣＴ对人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１凋亡的诱导作用及对细胞周期的阻滞效应。     

AZT对白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响

本研究探索端粒酶抑制剂3’-叠氮-2’,3’-脱氧胸腺核苷(AZT)对人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响。用MTT法检测不同浓度AZT分别作用24、48、72 h时KG-1a细胞增殖水平;流式细胞术检测AZT对KG-1a细胞周期及细胞凋亡的影响;TRAP-PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性;RT-PCR法检测细胞端粒逆转录酶(hTERT)mRNA的表达。结果表明,AZT能抑制KG-1a细胞增殖,抑制作用具有时间和浓度依赖性;随AZT浓度的增加,处于S期的细胞数目减少,G2/M期细胞数目增加,且出现凋亡峰;AZT作用后实验组细胞的端粒酶活性降低,hTERT-mRNA表达下降,下调程度与AZT浓度呈正相关。结论:AZT在体外能明显抑制KG-1a细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制与降低端粒酶活性、下调hTERT mRNA表达有关。     

肝癌干细胞标志物及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌干细胞生长的影响

目的:研究肝癌细胞系SMMC7721肿瘤干细胞表面标志物,探讨细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌细胞的生长抑制作用,以及其对肝癌细胞中具有干细胞特性群体的影响。方法:用流式细胞仪将肝癌细胞按细胞表面标志CD133、CD44进行分离,分为CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4个群体,采用脂质体法将细小病毒H-1非结构蛋白NS-1质粒转染入人肝癌细胞SMMC7721,采用G418筛选稳定转染的细胞克隆,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞NS-1基因的表达。流式细胞仪分析SMMC7721转染前后肿瘤干细胞表面标志CD133、CD90、CD44的表达和细胞生长周期,检测细胞群体的变化。以裸鼠成瘤实验和软琼脂克隆形成实验评价具肿瘤干细胞性质的肝癌细胞表面标志物以及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1转染对肝癌细胞生长的影响。结果:肝癌SMMC7721细胞分成CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4组亚群的细胞存在着异质性,4组亚群细胞中均有少数肿瘤干细胞样细胞能在软琼脂上形成克隆,其中CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群克隆形成率分别为3.5%和1.8%,CD133-CD44+、CD133-CD44-亚群克隆形成率为0.7%和0.5%。转染细小病毒H-1非结构蛋白NS-1后,4组亚群细胞克隆的形成率都显著下降。裸鼠成瘤实验提示,CD133+表型的细胞成瘤能力强于CD133-表型细胞,CD133-CD44+亚群细胞成瘤能力最弱。流式细胞仪分析显示转染NS-1后,CD133+群体细胞被明显抑制,由31.9%下降至6.3%,而CD90+和CD44+的表达未出现改变;转染NS-1后细胞S期百分率明显下降。结论:肝癌细胞表型为CD133+CD44+和CD133+CD44-亚群中富含肝癌干细胞,转染细小病毒H-1非结构蛋白基因NS-1的部分亚群SMMC7721细胞生长被抑制,提示其对肝癌细胞株中具有干细胞特性的CD133+群体有一定的抑制效应。     

转染p21WAF1基因降低K562细胞对VP-16的敏感性

为探讨p21^WAF1对K562细胞药物敏感性的谳节作用及其对VP－16诱导的K562细胞凋亡的影响，构建了p21^WAF1逆转录病毒表达载体，体外转染白血病细胞系K562。经RT－PCR和Western印亦检测得到稳定表达p21^WAF1的K562－p21^WAF1细胞克隆后，用MTT法和存活细胞计数法检测转染p21^WAF1的K562细胞对VP－16在剂量和作用时间上的敏感性变化，用DNA凋亡片段分析和流式细胞术检测其对VP－16诱导的K562细胞凋亡的影响。实验结果显示，外源性p21^WAF1的表达明显降低了VP－16诱导的K562细胞凋亡，降低了K562细胞对VP－16的敏感性。以上结果表明，p21^WAF1能通过抑制K562细胞的凋亡来降低其对VP－16的敏感性。     

人视网膜母细胞瘤耐药细胞系SO-Rb50/CBP的建立及耐药相关基因表达检测

目的用卡铂诱导人视网膜母细胞瘤SO-Rb50成为耐药细胞SO-Rb50/CBP,检测其生物学特性,并探讨其耐药机制。方法以人视网膜母细胞瘤SO-Rb50为亲本细胞,采用卡铂高浓度间歇诱导法诱导多药耐药细胞SO-Rb50/CBP。MTT法测定其药物敏感性及生长曲线、倍增时间;分别用免疫细胞化学、流式细胞术对MRP、GST-π蛋白表达进行检测,用RT-PCR检测耐药相关基因MRP、GST-π的表达。结果耐药细胞SO-Rb50/CBP的耐药指数为15.7。亲本细胞与耐药细胞群体倍增时间分别为44.32h和50.9h。SO-Rb50/CBP对CBP、DDP、VCR、MMC、VP-16和5-FU的耐药指数分别为15.7、6.89、5.68、4.58、2.28和1.88。免疫细胞化学SO-Rb50/CBP的GST-π和MRP表达的阳性率分别为96.19%和90.21%,亲本细胞两种蛋白的阳性率分别为20.12%和30.48%。SO-Rb50/CBP的MRP及GST-π的mRNA表达水平比SO-Rb50明显增高。结论诱导出耐卡铂的视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50/CBP呈高度耐药,且存在多药耐药现象。其耐药现象的产生,可能与GST-π和MRP耐药蛋白表达的增加有关。