ω—芋螺毒素研究进展

ω－芋螺毒素是电压敏感型钙离了通道的专一性阻断剂，是芋螺毒素中最重要的毒素，有着诱人的应用前景，作者对其生化与生物合成机制、分离及化学合成、毒性及神经药理作用、结构与性能关系以及应用进行了综述。     

新A超家族芋螺毒素Bt14.10的克隆及合成研究

目的从我国南海西沙附近海域的桶形芋螺（Conus betulinus）中克隆出新型A-超家族芋螺毒素Bt14.10,并利用化学方法合成该毒素,鉴定其二硫键连接方式。方法提取桶形芋螺毒腺管基因组DNA,基于非翻译区及内含子序列设计合成引物进行PCR,获得Bt14.10的序列。采用Fmoc-固相法合成线性肽Bt14.10,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式。结果发现一种新的A超家族芋螺毒素DNA序列Bt14.10,其编码的成熟肽序列为CAHSVPGMHPCKCNNTC-NH2,二硫键连接方式为＂C1-C3,C2-C4＂。结论BT14.10是一种新型A超家族芋螺毒素,具有A超家族芋螺毒素较为少见的ⅪⅤ型半胱氨酸骨架结构。     

基于无细胞蛋白合成系统体外合成芋螺毒素µ-PⅢA

目的 利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统(CFPS)体外合成芋螺毒素Mu-conotoxin PⅢA(μ-PⅢA).方法 通过PCR扩增芋螺毒素μ-PⅢA肽前体3种肽段(信号肽、前体肽与成熟肽)不同组合的DNA片段,将其分别克隆到pIVEX-2.4d载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定后得到阳性克隆.在大肠杆菌CF...     

SO3—一种新型具镇痛活性的芋螺多肽

目的：通过对中国南海线纹芋螺毒素的基因克隆、多肽的化学合成 量筛选,获得一种具有镇痛作用的芋螺多肽SO3。该太含有25个氨基酸残基CKAAGKPCSRIATNCCTGSCRSGKC－NH2,三对二硫键,其作用靶位为N型钙通道。方法：小鼠采用侧脑室给药,每只20μl。小鼠镇痛活性采用热板法、光热辐法及扭体法测定,大鼠采用脊髓鞘内套管给药,每只10μl,大鼠镇痛活性采用烫尾法及尾部压痛法。结果：生物活性测这表明该肽对小鼠的镇痛活性ED50为0．75μg/kg,对小鼠的急性毒性试验LD50为13．5mg/kg.LD50比ED50大18000倍,具有很高的用药安全性。论：国外已进入Ⅱ-Ⅲ期临床实验的ω－芋螺毒素MVIIA进行对照实验的结果表明两者活性相当,SO3毒副作用更低,而且作用靶位与MVIIA类似,无成瘾性。SO3具有诱人的药物发展前景。     

α-芋螺毒素Lt1.1的克隆、合成及靶点鉴定

目的 发现作用于神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂,为研制新型镇痛药和神经生物学工具奠定基础.方法 根据芋螺毒素A超家族DNA中保守的内含子及3′端非转录区(3′UTR)设计引物,从中国南海信号芋螺(Conus litteratus)中克隆获得新芋螺毒素Lt1.1序列.固相法合成Rink树脂肽,经裂解、空气氧化折叠、纯化后获得目的肽,利用两步氧化折叠法鉴定其二硫键连接方式.将神经元nAChR各亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞中表达,利用双电极电压钳检测通道电流.结果 获得一种新α-芋螺毒素Lt1.1序列(GCCSHPACNVNNPDIC-NH2),其二硫键连接方式为"C1-C3、C2-C4",作用靶点为nAChR α3β2和α3β4亚型,IC50 分别为166.76和190.00 nmol/L.结论 Lt1.1是一种典型的4/7型α-芋螺毒素,其选择性抑制了nAChR α3β2和α3β4亚型.     

中国南海新型α-芋螺毒素Im1.6的克隆及合成

目的从中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3'端快速扩增方法(3'RACE),从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Im1.6,其编码的成熟肽序列为GCCDIPDCYNKNREQC-NH2,二硫键连接方式为C1-C3,C2-C4。结论 Im1.6是一种新的α4/7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-芋螺毒素显著不同。     

新的M家族芋螺毒素的克隆及进化分析

目的从中国南海芋螺中寻找新的M家族芋螺毒素。方法应用3′RACE及巢式PCR进行基因克隆,将得到的目的基因连接入pGM-T载体、转化并测序,用进化分析软件对得到的新序列进行进化分析。结果从6种芋螺毒腺管中获得8个新的M家族芋螺毒素前体肽序列,其成熟肽含有15~21个氨基酸残基。结论这些新的M族毒素与已报道的M家族毒素序列同源性较低,是Mini-M家族的新成员。     

新芋螺毒素S03的复性研究

目的 应用HPLC法，研究肤浓度、缓冲体系、助折叠还原剂、温度等一系列条件对化学合成的芋螺多肽毒素S03折叠的影响。方法 用仪器和手工合成新芋螺毒素SO3，对合成的S03采用一步法折叠研究，折叠产物用HPLC方法检测。结果 S03在不同折叠体系中折叠效果不同。结论 S03在含GSSG／GSH或Cys的醋酸铵体系中4℃、pH8时折叠效果最佳。     

中国南海新型甜芋α-螺毒素Iml．6的克隆及合成、

目的从中国南海堂皇芋螺（Conusimperialis）中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3’端快速扩增方法（3’RACE）,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Iml．6,其编码的成熟肽序列为GccDIPDCYNKNREQc—NH：,二硫键连接方式为“c1．c3,c2．C4”。结论Iml．6是一种新的α4／7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-一芋螺毒素显著不同。     

芋螺毒素GI抗血清制备及中和活性研究

目的 测定芋螺毒素GI与牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫小鼠后产生的抗血清是否具有中和GI毒素作用.方法 戊二醛法制备GI-BSA偶联物,免疫小鼠,制备GI小鼠抗血清,应用抗血清的抗体中和实验,验证其对GI的解毒作用.结果 SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,GI与BSA成功偶联,GI-BSA在>标志物相对分子质量(120×103)处有两条新蛋白带;GI-BSA(99 μg/只)每隔2周免疫1次,共免疫4次,第4次免疫后第10天抗血清中和滴度效价>1:64 000;混合100及200 μl 小鼠抗血清与≥1 LD50剂量GI,腹腔注射,100 μl 血清可使1×LD50毒素(16.3 μg/kg)组小鼠75%存活,200 μl血清可使25.8 μg/kg毒素组小鼠75%存活.结论 基于GI-BSA半抗原免疫的小鼠抗血清对GI毒素具有明显的解毒作用.     

芋螺毒素SO3对小鼠中枢神经系统作用的研究

目的研究芋螺毒素SO3对小鼠中枢神经系统的作用,并探讨其可能的作用机制。方法观察芋螺毒素SO3脑室给药对小鼠一般行为、自发活动、协调运动及阈下戊巴比妥钠催眠作用的影响,以及阿托品、美加明、酮色林、螺哌酮、地西泮、东莨菪碱预防给药对芋螺毒素SO3脑室注射所致震颤的拮抗作用,探讨其对中枢神经系统影响的可能机制。结果芋螺毒素SO3(0.75~12μg·kg-1,icv)引发小鼠剂量依赖性震颤,显著降低小鼠自发活动计数;芋螺毒素SO3(1.5~12μg·kg-1,icv),造成小鼠显著性运动障碍;芋螺毒素SO3(0.75、1.5μg·kg-1,icv)对阈下戊巴比妥钠催眠作用有协同作用;阿托品、美加明、东莨菪碱(1~10mg·kg-1,ip)、地西泮(1、5mg·kg-1,ip)对芋螺毒素SO3诱发的小鼠震颤无抑制作用;而螺哌酮(1、2.5mg·kg-1,ip)、酮色林(0.1~1mg·kg-1)以及高剂量东莨菪碱(20mg·kg-1,ip)、地西泮(10、20mg·kg-1,ip)可以显著抑制芋螺毒素SO3诱发的小鼠震颤。结论芋螺毒素SO3对小鼠神经系统有一定抑制作用,同时伴有剂量依赖性震颤,其机制可能与中枢5-羟色胺系统有关。     

α-芋螺毒素构效关系的研究进展

α-芋螺毒素（α—CTX）是芋螺毒素的重要家族，由12～19个氨基酸、2～3对二硫键组成，是迄今发现的最小的神经肽类毒素。α-芋螺毒素能特异性地抑制肌肉型或神经元型的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），并能进一步区分不同的神经元型nAChR亚型。由于其相对分子质量小、活性高，不仅可直接开发为疗效特异的镇痛及抗癫痫等药物，还可作为研究神经生物学工具，鉴定nAChR亚型功能。本文对α—CTX研究的最新进展予以评述，着重介绍了α—CTX的作用靶位特性、构效关系及其应用进展。     

α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C融合蛋白的制备及其抗血清活性研究

目的 制备α-芋螺毒素GI抗血清,为其中毒救治提供有效手段.方法 构建包含α-芋螺毒素GI、PADRE和破伤风毒素C片段(TTC)融合蛋白的原核表达载体,原核表达GI-PADRE-TFC融合蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗体滴度,并测定其对小鼠的抗毒活性.结果 获得GI-TTC融合蛋白69.5 mg.GI-TTC融合蛋白免疫小鼠第5次免疫后血清对GI、GI-BSA的抗体滴度分别达到1∶102400及1∶204800.100、200 μl融合蛋白抗血清对2.0×LD50的α-芋螺毒素GI中毒小鼠存活率分别为14.3％、25.0％,且小鼠死亡时间显著延长.结论 α-芋螺毒素GI与破伤风毒素C片段的融合蛋白具有较好的免疫原性,其产生的抗血清对α-芋螺毒素GI具有一定中和活性.     

ω-芋螺毒素SO3对大鼠慢性神经痛镇痛作用及对血清IL-6浓度影响

目的 观察持续鞘内注射新型特异性N型电压依赖性钙通道阻滞剂-ω-芋螺毒素SO3对慢性压迫性损伤所致的神经痛大鼠的长期镇痛效果,及其对神经痛大鼠血清IL-6浓度的影响。方法 建立大鼠CCI模型,比较观察连续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3后大鼠热刺激爪退缩阈值和冷水中抬足次数变化以及血清IL-6水平的改变。结果 CCI大鼠术后出现热刺激爪退缩阈值缩短（P〈0．01）、冷水中抬足次数增加（P〈0．01）;血清中IL-6水平明显升高（P〈0．01）。持续鞘内注射生理氯化钠溶液对这两种阈值变化以及血清中IL-6水平无明显影响;持续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3（60ng／h）能明显提高CCI大鼠热刺激爪退缩阈值（P〈0．01）,减少冷水中抬足次数（P〈0．01）;并显著降低血清中IL-6水平（P〈0．01）。结论 长期持续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3可有效地治疗CCI大鼠的冷、热痛觉过敏,并显著降低CCI大鼠血清IL-6浓度。     

鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对CCI大鼠脊髓及坐骨神经iNOS蛋白表达的影响

目的 通过检测鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)模型大鼠脊髓及坐骨神经诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响,探讨慢性神经痛发展过程中Ca2 对iNOS的作用.方法 雄性SD大鼠40只,随机分为4组(n=10):N组为正常对照组,C组为CCI后14天组,CN组为CCI 7天后连续鞘内注射生理盐水7天组,CS组为CCI 7天后连续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3(30ng/h)7天组.用Western blot方法检验各组动物脊髓及坐骨神经结扎部位中段和远端iNOS蛋白表达量的变化.以GAPDH表达量作为内参照.结果 正常大鼠脊髓及坐骨神经标本未见iNOS表达,CCI大鼠结扎侧坐骨神经及同侧脊髓均有较强的iNOS表达,持续鞘内注射ω-芋螺毒素SO3后此种表达减弱.结论 CCI大鼠脊髓和受损坐骨神经iNOS表达增加,鞘内注射ω-芋螺毒素SO3可降低CCI大鼠上述部位iNOS表达.在慢性神经痛的发展过程中,Ca2 通道阻滞剂对iNOS的表达有一定作用.     

αO⁃芋螺毒素GeXIVA[1,2]在炎性痛模型上的镇痛作用研究

目的 探究α-芋螺毒素GeXIVA[1,2]在炎性痛中的镇痛作用.方法 建立足底切口痛、福尔马林炎性痛和完全弗氏佐剂(CFA)炎性痛模型,筛选建模成功的小鼠随机分为生理盐水阴性对照组,吗啡阳性对照组及GeXIVA[1,2]低(0.2 nmol)、中(1 nmol)、高(5 nmol)剂量组.对于CFA模型和足底切口模型...     

鞘内注射ω-芋螺毒素SO3对神经痛大鼠脊髓CGRP和P物质表达的影响

目的 通过研究鞘内注射新型N型钙通道阻滞剂ω-芋螺毒素SO3对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)模型大鼠脊髓降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)含量的影响,探讨N型钙通道在伤害性信息传递中的作用.方法 雄性SD大鼠72只,随机均分为9组,其中3组为假手术和单纯制作CCI模型后3、14天组,3组为单次鞘内注射生理盐水和不同剂量SO3组,另3组为持续鞘内注射生理盐水和不同剂量SO3共7天组.用免疫组织化学染色法检测各组动物脊髓标本中免疫反应阳性物质CGRP-LI、SP-LI的阳性面积比例、目标光密度和积分光密度.结果 大鼠CCI后脊髓背角CGRP-LI、SP-LI阳性面积比例、目标光密度和积分光密度均显著升高,单次或持续鞘内注射生理盐水对其无明显影响,单次或持续鞘内注射SO3均可剂量依赖性地抑制其上升.结论 神经损伤后脊髓CGRP、SP释放增多,鞘内注射SO3可以减轻此反应,提示N型钙通道阻滞剂可在脊髓水平部分阻断伤害性信息传递.     

应招飞行学员幽门螺杆菌—IgG及细胞毒素相关蛋白A—IgG检测的意义

由中华医学会航空航天医学分会主办的全国第六次航空航天医学学术会议将于 2 0 0 2年 6月 2 6～2 9日在浙江宁波市召开。本次会议共收到应征论文 2 1 9篇 ,经专家评审组采用双向多重盲法 (作者与审者间双盲、审者间互盲 )审稿方式初选后 ,再集中会审 ,充分保证了公平、优质地录选稿件。最终录用 1 2 9篇 ,其中英语专题会交流 9篇 ,大会交流 1 7篇 ,专题会交流 1 0 3篇。现将这次会议入选论文以摘要形式在本刊预先发表。为了方便检索与学术交流 ,我们在每篇摘要前加了顺序编号 ,并标注了关键词 ;英语专题会交流论文摘要以中英文对照形式刊发 ;中文摘要加注了中国图书馆分类法分类号。     

A型肉毒毒素轻链抑制剂苯并硒唑衍生物的合成及活性评价

目的 合成一系列含芳香基、直链取代基苯并硒唑,抑制A型肉毒毒素(BoNT/A)轻链活性,获得A型肉毒毒素(BoNT/A)的解毒剂.方法 以邻氨基苯甲酸甲酯为起始原料,经重氮化、酰氯化合成中间产物2?硒化苯甲酰氯,再与含不同取代基的芳香胺、直链胺反应合成一系列依布硒啉(ebselen)类及其他苯并硒唑衍生物.采用荧光共振...