大鼠牙乳头细胞体外培养和矿化的实验研究

目的　观察体外培养的大鼠第一磨牙牙乳头细胞的生物学特征。方法　大鼠第一磨牙牙乳头细胞培养 ,免疫组织化学染色、钙盐染色。结果　培养的大鼠牙乳头细胞表达Ⅲ型胶原、纤维黏连蛋白、碱性磷酸酶 ,当细胞培养于含 5mmol/Lβ-磷酸甘油钠和 5 0 μg/mlL -维生素C的培养液中时 ,细胞可形成矿化的胞外基质。结论　培养的大鼠牙乳头细胞保留体内的某些特征 ,并可用于研究牙髓组织的钙化调节。     

体外诱导培养大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达

目的:观察体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和I型胶原蛋白合成的变化。方法:原代培养法获得大鼠牙乳头细胞,在条件培养基中进行诱导培养,在不同时间进行钙结节染色,ALP染色和定量测定,ELISA法和RT-PCR法测定细胞I型胶原蛋白的量和mRNA表达水平。结果:体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞形成含钙化物的细胞结节,体外培养至12d的诱导组细胞ALP高于对照组(P<0.05),细胞内I型胶原表达量高于对照组(P<0.05),且I型胶原mRNA表达水平上调(P<0.05);培养15d后诱导组细胞分泌的I型胶原高于对照组(P<0.05)。结论:大鼠牙乳头细胞在体外分化的过程中碱性磷酸酶活性明显增高,矿化能力增强,并不断合成和分泌I型胶原形成胞外基质。     

人牙乳头细胞体外矿化特征及其分化表型的表达

目的：观察人牙乳头细胞体外矿化特征。方法：组织块法培养人牙乳头细胞,取第三代细于矿化液中长期培养,检测不同培养时间细胞碱性磷酸酶（alkaline phospha tase,ALP)活性,骨钙素（osteocalcin,OC)活性,且倒置显微镜观察细胞生长。结果：体外培养的牙乳头细胞呈现以下表现特征：复层增长,胞外基质分泌与矿化结节形成。在β-GP和L－抗坏血酸存在条件下培养第14天细胞内ALP活性开始升高而OC在21d才开始升高,有细胞外基质分泌,但未见矿化。35d产生特异性牙本质矿化结节。42天以后,OC、ALP活性降低。结论：培养的人牙乳头细胞具有成牙本质细胞某些表型,可在体外形成牙本质或牙本质样矿化物质,可作为研究牙本质形成机制的实验模型。     

大鼠牙乳头细胞旁分泌效应对巨噬细胞分泌炎症因子的调控作用

目的:研究大鼠牙乳头细胞(rat dental papilla cells,RDPCs)对LPS活化的巨噬细胞分泌免疫因子的影响.方法:分离SD大鼠牙胚,酶消化法原代培养牙乳头细胞并进行矿化诱导和成脂诱导,茜素红染色观察矿化结节形成.油红O染色观察脂滴形成.CCK8法检测大鼠牙乳头细胞条件培养基(rat dental papilla cells' conditioned medium,RDPC-CM)对巨噬细胞增殖能力的影响,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的影响,Griess reagent法检测RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子NO的影响.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:原代培养24 h后,大鼠牙乳头细胞从组织块中爬出,传代后可得到纯化大鼠牙乳头细胞;茜素红染色见矿化诱导组中出现散在的红色矿化结节;油红O染色后可见经成脂诱导的牙乳头细胞中脂滴形成;CCK8结果表明,RDPC-CM对巨噬细胞增殖能力无影响;ELISA结果显示,大鼠牙乳头细胞条件培养基可对LPS活化巨噬细胞分泌细胞因子产生作用,表现为条件培养基作用于巨噬细胞24h可减少细胞分泌TNF-α,而对IL-1β和IL-6分泌无影响;Griess reagent法结果显示,RDPC-CM对LPS活化的巨噬细胞分泌NO无影响.结论:大鼠牙乳头细胞条件培养基作用于LPS活化的巨噬细胞,可使巨噬细胞分泌TNF-α下降,提示牙乳头细胞具有一定的免疫调控作用.     

aFGF和TGFβ1联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化

目的建立猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化的体外诱导方案。方法联合应用aFGF和TGFβ1对体外培养的猪牙乳头细胞进行平面诱导,观察诱导后细胞的形态学变化,通过Von Kossa染色检测诱导后细胞的矿化能力,并采用免疫荧光染色和RT-PCR检测成牙本质细胞特异性标志物——DSP蛋白和DSPP mRNA在诱导后细胞中的表达。结果诱导后部分细胞出现细长的单侧细胞突起,在矿化液培养2周后形成典型的矿化结节,并且表达DSP蛋白和DSPP mRNA。结论联合应用aFGF和TGFβ1可以诱导体外培养的猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化。     

小鼠牙胚发育无血清体外培养模型的建立

目的：建立小鼠牙胚发育无血清体外培养模型。方法：胎龄17d的Balb/c胎鼠上颌第一磨牙牙胚，BGJb无血清半固态培养基中恒温培养4、6、8－16d。终止培养后常规制备石蜡切片，HE及von Kossa染色。结果：初始培养时牙胚处于帽状晚期，成翻器分为三层，紧邻基底膜的牙乳头细胞列不规则，核多为圆形。体外培养4－6d后，牙胚在体外进一步生长。培养6d后，牙尖处成牙本质细胞分化为高柱状，并在局部分泌基质。体外培养8d，牙胚进入钟状晚期，有基质带形成。培养16d后，牙冠已基本形成，根方出现上皮隔。von Kossa染色结果显示：培养10d后，牙胚基质带出现阳性着色。结论：建立了小鼠磨牙发育无血清体外培养模型，该 模型在体外真实地再现了成牙本质细胞、成釉细胞的分化和基质分泌、矿化等生理过程，是一种良好的生物模型。     

人类牙乳头细胞的体外培养及细胞生物学性状研究

目的　体外分离培养人类牙乳头细胞,并对传代细胞的生物学特性进行研究。方法　选择3~4月胎龄 的自然流产人胚胎,分离牙乳头,组织块法培养人类牙乳头细胞并鉴定。观察细胞的生长特性,经Ⅰ型胶原、纤维 粘连蛋白和层粘连蛋白免疫细胞化学染色及细胞矿化诱导后的钙盐染色对细胞的生物学性状进行研究。结果　 分离培养的人类牙乳头细胞在体外生长良好,细胞及分泌基质中的Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白表达阳 性。将培养细胞行矿化诱导后,细胞可形成钙化基质。结论　通过机械分离及贴壁法可获得人类牙乳头细胞,其 传代细胞在基质形成和矿化能力方面与体内人牙乳头细胞有相似性,有潜力作为牙组织工程的种子细胞。     

体外培养的人牙乳头间充质细胞的矿化特征

目的;观察体外２的人牙乳头间充质细胞矿化特征,深入研究成牙本质细胞的分化和牙本质形成。方法：第４代人牙也头间充质细胞连续培养３５ｄ后,进行组织学染色,透射电镜和扫描电镜观察。结果：人牙乳头间质细胞可出现复层生长和形成矿化结节,ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ杂色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积;细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出现典型的矿化影像。     

FGF18对人牙乳头间充质细胞增殖和矿化能力的影响

目的：初步探讨成纤维细胞生长因子18对人牙乳头间充质细胞增殖和矿化能力的影响。方法：采用MTT法和酶动力法检测FGF18对人牙乳头间充质细胞增殖、ALPase活性的影响，茜素红染色检测钙结节形成情况。结果：FGF18刺激人牙乳头间充质细胞48h后，在20μg／L、50μg／L、100μg／L、200μg／L显著促进细胞的增殖（P〈0．01），对细胞的ALP合成无显著性影响（p〉0．05），72h后10μg／L、20gμ／L、50μg／L、100μg／L、200μg／L均显著促进细胞增殖和ALP的合成：此外100μg／L和200μg／LFGF18可明显促进细胞钙化结节的形成（p〈0．05），结论：FGF18在人牙乳头间充质细胞的分化和矿化过程中可能起着重要的调节作用。     

牛血浆纤维粘连蛋白对培养的鼠牙乳头组织的影响

目的观察牛血浆纤维粘连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）对牙乳头组织及细胞的作用。方法对大鼠牙乳头和牙胚组织进行器官培养，实验组将微孔滤膜用８０ｍｇ／ＬＦＮ液浸润２ｈ，然后将牙乳头组织置薄膜上培养３、６天，同时设对照组，牙胚培养３、６、９天，常规组织学染色。结果牙胚在体外可有成牙本质细胞分化和前期牙本质的形成。实验组于牙乳头组织和滤膜交界处出现极化细胞，而对照组则未出现上述现象。结论ＦＮ参与了成牙本质细胞的极化过程。     

小鼠重组OSF-2对人牙周膜细胞附着和伸展的影响

目的：观察小鼠重组牙周膜细胞特异性因子2（OSF-2）对牙周膜细胞附着和伸展的作用。方法：采用固相结合分析实验及四唑盐比色等细胞生物学技术,观察牙周膜细胞在OSF-2基质上的附着能力和伸展率。结果：牙周膜细胞在OSF-2基质上附着和伸展良好,当浓度在20ug／ml以上时,作用尤其显著（P〈0．01）,与在FN基质的生长结果相似。结论：小鼠重组OSF-2可有效促进牙周膜细胞的附着和伸展。     

大鼠颌下腺肌上皮分化的研究

目的 :观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究 ,并探讨肌上皮细胞的组织发生。方法 :采用组织块原代培养法 ,通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段 ,对不同时期大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。结果 :肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞见于体外培养第 3d。肌微丝及Actin阳性细胞分别最早出现于培养第 6d和 7d。此结果与体内研究结果相一致。结论 :肌上皮细胞可能来源于上皮干细胞 ;体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。     

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

目的利用牙胚细胞（TGC）作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞（DPSC）、外胚间充质干细胞（EMSC）分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白（DSP）的表达和碱性磷酸酶（ALP）活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7 d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组（P<0.05）。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7 d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著（P<0.05）。共培养组3、7 d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC。     

Analysis and optimisation of the behaviour of a certain class of intermediates in electrosynthesis

The behaviour of an electrochemically generated Cypridina luciferin analogue system in non-flow, tank-flow, and piston-flow cells is analysed via simplified substance balance models. The existence of optimal species-capture conditions is demonstrated to be a function of (mean) residence times in the cells.     

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??Objective    To investigate effects of dental papillae cells on the proliferation of dental pulp stem cells??DPSCs?? and its mechanism. Methods    DPSCs and dental papillae cells were cultured??the co-cultured systems of DPSCs and dental papillae cells were established. The intracellular mineralization nodes were observed. The cell cycle of DPSCs was detected by flow cytometry. Finally??when the inhibitor of Notch??PHI??was administrated??the expression of Notch1??Jagged1 mRNA and protein was examined. Results    The obvious mineralization nodules were observed in DPSCs after 14 d of co-culture. Flow cytometry results showed that stratified co-culture promoted the proliferation of DPSCs. RT-PCR and western blot results showed that the expression of Notch1??Jagged1 mRNA and protein in the co-culture group was significantly increased compared with control group. Conclusion    Stratified co-culture of DPSCs and dental papillae cells might promote the mineralization and proliferation by activating Notch signal pathway.     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 :体外分离、培养人牙髓干细胞 ,从不同角度对其进行鉴定。方法 :采用胶原酶和Dispase酶联合消化法培养人牙髓干细胞 ,有限稀释法分离纯化 ,将克隆形成的细胞通过透射电镜观察其超微结构、流式细胞仪细胞周期分析及抗波形丝蛋白 (Vimentin)、CD44、骨粘素 (ON)、牙本质涎蛋白 (DSP)免疫组化染色方法进行鉴定。结果 :通过有限稀释法获得了人牙髓干细胞克隆 ,透射电镜下观察这种克隆形成细胞具有干细胞典型的超微结构特点 ,大多数细胞处于G0 /G1期 ,为细胞周期的静止期 ,并具有牙源性未分化间充质细胞的表型特点。结论 :克隆化培养是人牙髓干细胞较为有效的分离纯化方法 ,该方法分离的人牙髓干细胞具有干细胞的结构、细胞周期及表型特点。     

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??Objective    To study the effect of different copper content of titanium-copper alloy on adhesion and migration of osteoblasts??and to find the optimal copper content. Methods    The titanium-copper alloy with copper content of 2%??5% and 10% was prepared and named Ti-2wt% Cu??Ti-5wt% Cu and Ti-10wt% Cu??respectively.The pure titanium material without copper was used as the control??Ti group. Mouse MC3T3-E1 osteoblasts were cultured on the surface of these materials.??1??Morphological observation of osteoblasts??the surface morphology of osteoblasts was observed??the cytoskeleton-actin staining was observed.??2??The proliferation of osteoblasts was detected by MTT assay.??3??Cell migration was analyzed by cell scratch test. SPSS 17.0 software was used for statistical analysis. Results    ??1??Under scanning electron microscope??cells showed more rapid and fuller adhesion and expansion on the Ti-5wt%Cu??Ti-10wt%Cu when the cells were seeded for 6 and 24 hours??but Ti-5wt%Cu was more obvious.??2??By phalloidine staining??the cytoskeleton actin filaments were observed only in the Ti-10wt%Cu group when the cells were inoculated with phalloidin for 2h.The spreading area of Ti-5wt%Cu was the largest at 4h and 24h.??3??The MTT results showed??the number of osteoblasts on the surface of materials increased with the increase of copper content??that is??Ti-10wt%Cu??Ti-5wt%Cu??Ti-2wt%Cu??Ti??the difference being statistically significant ??P??0.05??. However??there was no significant difference between Ti-10wt% Cu and Ti-5wt% Cu on the 7th day.??4??After 24 and 48 hours of scratches??the average width of scratches was Ti??Ti-2wt%Cu??Ti-10wt%Cu>Ti-5wt%Cu and there was significant difference among the four groups ??P??0.05??. Conclusion    In the range of copper content detected in this experiment??osteoblast adhesion??the formation of cytoskeleton and cell migration are the best in the range of 5% of copper content.     

外胚间充质干细胞的体外分离和鉴定

目的 :探讨SD大鼠外胚间充质干细胞的超微结构及经体外长期传代后变化程度。方法 :电镜分析组织细胞的超微结构 ;用流式细胞仪检测传代细胞的干细胞特异性标志CD57和P75的变化。结果 :细胞增殖旺盛 ,代谢活跃 ,处于未分化状态。P0 -P5期间 ,CD57和P75阳性细胞的比例没有明显降低 ,从P6开始 ,下降迅速 ,至P8-P10 期间已不可测。结论 :①干细胞可以在体外维持生长并增殖 ;②长期培养后 ,干细胞比例下降 ,甚至消失 ,这可能存在两种原因 :其一 ,干细胞经过体外培养已经完全分化了 ,失去了原有的表型 ;其二 :干细胞仍然存在 ,但缓慢增殖 ,被增殖迅速的瞬时扩增细胞稀释 ,以至无法检测