新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的：探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法：首次采用注射器灌注法分离新生24 h Wistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM /F12 培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。 结果：新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论： 大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。     

新生鼠下丘脑结节乳头核组胺能神经细胞的原代培养

目的 探讨新生鼠下丘脑结节乳头核(TM)组胺能神经细胞的体外培养方法。方法 从新生鼠(24h内)下丘脑后部分离出TM神经细胞，采用含有B27的Neurobasal Medium培养液进行体外原代培养。应用免疫细胞化学染色对培养的细胞进行鉴定。结果 从新生鼠下丘脑中分离的TM神经细胞，在本实验条件下生长良好。原代培养7～9d的神经细胞在形态上趋向成熟。免疫细胞化学染色结果表明培养的神经细胞呈组胺免疫反应阳性。为组胺能神经细胞。结论 新生鼠下丘脑TM神经细胞可进行体外原代培养，它可作为研究中枢组胺神经系统的体外细胞模型。     

新生鼠下丘脑结节乳头核组胺能神经细胞的原代培养

目的 探讨新生鼠下丘脑结节乳头核(TM)组胺能神经细胞的体外培养方法。方法 从新生鼠(24 h内)下丘脑后部分离出TM神经细胞,采用含有B27的Neurobasal Medium培养液进行体外原代培养。应用免疫细胞化学染色对培养的细胞进行鉴定。结果 从新生鼠下丘脑中分离的TM神经细胞,在本实验条件下生长良好。原代培养7~9 d的神经细胞在形态上趋向成熟。免疫细胞化学染色结果表明培养的神经细胞呈组胺免疫反应阳性,为组胺能神经细胞。结论 新生鼠下丘脑TM神经细胞可进行体外原代培养, 它可作为研究中枢组胺神经系统的体外细胞模型。     

枸杞子等八种中药提取液对体外培养细胞和小鼠腹腔巨噬细胞影响的实验研究

本文应用细胞培养和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能观察测定的方法,研完了龟板、补骨脂、田七、枸杞子、莪术、五味子、木瓜和云芝对体外培养二倍体细胞形态、生长速度及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数的变化。实验结果提示龟板、补骨脂、枸杞子均明显地促进二倍体细胞的生长增殖速度,提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,而木瓜能减缓细胞的生长降低巨噬细胞吞噬作用。本研究为临床应用和探讨其作用机理提供一定的实验依据。     

硫酸锌拮抗矽尘细胞毒作用的研究

采用体外大鼠红细胞溶血实验和小鼠腹腔巨噬细胞体外培养的方法，研究了硫酸锌与石英尘对大鼠红细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和联合作用。结果表明：硫酸锌能明显拮抗体外石英尘对细胞的毒性作用，表现为染尘后同一时间硫酸锌与石英尘联合作用组和单纯石英尘作用组相比，红细胞溶血百分率降低（Ｐ〈０．０５），巨噬细胞成活率明显提高（Ｐ〈０．０５）；巨噬细胞胞浆内乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）漏出量降低（Ｐ〈０．０５）。推测其拮抗作用机     

小鼠腹腔巨噬细胞培养

巨噬细胞在免疫学、尘肺等研究方面应用很广。国内在分离巨噬细胞时多从豚鼠肺或大鼠腹腔中取得,但此种方法须用体重400～500g的成年豚鼠,动物来源往往发生困难。本文根据国外的方法,用国内的实验条件,从小鼠腹腔中获取巨噬细胞。由于小鼠容易得到,其腹腔巨噬细胞在体外容易生长,存活时间较长,是一种可取的方法。     

硫酸锌拮抗矽尘细胞毒作用的研究

采刚体外大鼠红细胞溶血实验和小鼠腹腔巨噬细胞体外培养的方法,研究了硫酸锌与石英尘对大鼠红细咆、小鼠腹腔巨噬细胞的联合作用。结果表明,硫酸锌能明显拮抗体外石英尘耐细胞的毒性作用,表现为染尘后同一时间硫酸锌与石英尘联合作用组和单纯石英尘作用组相比,红细胞溶血百分率降低(P<0.05);巨噬细胞成活率明显提高(P<0.05);巨噬细胞胞浆内乳酸脱氢酶(LDH)漏出量降低(P<0.05)。推测其拮抗作用机理可能为Zn~( 2)与石英尘表面离解的硅烷醇基团相结合,阻隔了该丛团对细胞的作用,从而降低了石英尘的毒作用。     

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养的简便方法。方法以无血清的RPMI1640培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。通过细胞形态学观察,台盼蓝染色计数细胞活力,瑞氏染色计算纯度,细胞吞噬墨汁颗粒测定其吞噬率,鉴定这些细胞是巨噬细胞。结果本实验获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简便的巨噬细胞体外分离培养方法。     

成年SD鼠骨髓基质干细胞培养及向神经元样细胞定向分化的研究

目的 探讨体外培养、扩增骨髓基质干细胞的方法，诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞定向分化。方法 采用全骨髓法培养成年SD大鼠股骨骨髓基质干细胞。传至第5代，用全反式维甲酸诱导分化，于诱导后第5小时行神经细胞特异性抗原MAP-2和胶质细胞特异性抗原GFAP鉴定。结果 成年鼠骨髓基质干细胞经全反式维甲酸诱导30min后可见神经元样细胞出现，经MAP-2免疫组化鉴定阳性。结论 (1)骨髓基质干细胞在体外扩增迅速，纯化需时短。(2)骨髓基质干细胞在全反式维甲酸诱导下向神经元样细胞分化。     

新生大鼠视网膜神经元的改良培养及鉴定

目的探讨新生大鼠视网膜神经元获取和体外培养的方法,为视网膜神经细胞的基础研究提供合适的模型。方法采用酶消化法获取生后7—8天的SD（Sprague—Dawley）乳鼠的视网膜神经细胞,使用DMEM／F12培养液在体外培养,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学鉴定细胞类型。结果0．25％胰蛋白酶和0．02％EDTA联合消化能使视网膜神经细胞分散,获得单细胞悬液;多聚赖氨酸包被培养皿有助于神经细胞贴壁生长;体外培养第7天的视网膜神经细胞中,视网膜神经元占80％左右,其中50％以上为光感受器细胞。结论酶消化法原代培养视网膜混合神经细胞简单、可行,为视网膜神经细胞的基础研究提供良好的体外模型。     

Differentiation of rat neural stem cells and its relationship with environment

Objective To explore the differentiation fates of rat neural stem cells (NSCs) in different environmental conditions. Methods NSCs derived from 16-day-old rat embryo were proliferated in vitro and implanted into the brain of rats with intra-cerebral hemorrhage. At the same time some NSCs were co-cultured in vitro with Schwann cells derived from newborn rats. MAP-2, GFAP and GalC (which are the specific markers of neural cells, astrocytes and oligodendrocytes respectively),BrdU and β-tubulin were detected by immunohistochemical and immunofluorescent methods.Results BrdU positive cells that were implanted into the brain distributed around the hemorrhagic area.The majority of them were GFAP positive astrocytes while a few of them were β-tubulin positive neural cells or GalC positive oligodendrocytes. After being co-cultured with Schwann cells in vitro,NSCs are predominately shown β-tubulin and MAP-2 positive,and only a minority of them were GFAP or GalC positive.Condusions The hemorrhagic environment in vivo induces NSCs to differentiate mainly into astrocytes while co-culture with Schwann cells in vitro induce the majority of NSCs to differentiate into neural cells.     

黄芩苷对体外培养神经干细胞分化的影响

[目的]探索黄芩苷对体外神经干细胞分化的影响。[方法]培养胎鼠脑皮质神经干细胞,应用细胞免疫化学方法,以神经元特异性的微管相关蛋白-2(MAP-2)和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)为标记,对分化后的神经干细胞进行区分,评价黄芩苷对神经干细胞分化的影响。[结果]黄芩苷可以促进神经干细胞向神经元分化,其中高剂量组明显优于对照组。[结论]黄芩苷具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

黄芩苷对体外培养神经干细胞分化的影响*

【目的】探索黄芩苷对体外神经干细胞分化的影响。【方法】培养胎鼠脑皮质神经干细胞，应用细胞免疫化学方法，以神经元特异性的微管相关蛋白-2（MAP-2）和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为标记，对分化后的神经干细胞进行区分，评价黄芩苷对神经干细胞分化的影响。【结果】黄芩苷可以促进神经干细胞向神经元分化，其中高剂量组明显优于对照组。【结论】黄芩苷具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

Induction of Angiogenesis and Neurogenesis by Serum from Rats Treated with Shunaoxin Dropping Pills

Objective Shunaoxin Dropping Pills (SDPs), a Chinese patent medicine, has been used widely in China for the treatment of headache, amnesia, and insomnia. The aim of the present study is to observe the effect of SDPs on inducing angiogenesis and neurogenesis in vitro. Methods The present testing system using the serum obtained from animals ig treated with SDPs and a co-culture system in vitro was used to investigate if SDPs promotes brain microvascular endothelial cells (BMECs) tube formation and neural differentiation of neural stem/progenitor cells (NSPCs), which plays important roles in angiogenesis and neurogenesis. Results The SDPs serum sampled from rats ig treated with SDPs for 3 d dose-dependently promoted the tube like structure formation of cultured BMECs, and enhanced the fraction of MAP-2 positive cells of NSPCs, which co-cultured with the BMECs and astrocyte. In addition, there was no significant change in the percentage of glial fibrillary acidic protein positive cells. Conclusion Our results show that SDPs serum can induce neural differentiation and BMECs tube formation in vitro.     

EPO促进胚胎神经干细胞向神经元分化的形态学研究

目的：探讨促红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）促进神经干细胞（neural stem cells ,NSCs）分化的形态学表现,为细胞移植治疗脑部疾病和脑损伤提供实验依据。方法取大鼠14 d胚胎脑皮质先增殖培养,后贴壁分化培养。适时镜下观察,免疫细胞化学染色,用nestin鉴定NSCs ,GFAP鉴定神经胶质细胞、MAP2鉴定神经元。选取第3代 NSCs ,向培养基中分别添加不同剂量的 EPO ,浓度分别为0．5u/ml ,5u/ml ,50u/ml ,500u/ml ,并设不添加EPO的对照组,MAP2免疫荧光共聚焦显微镜观察NSCs向神经元方向的分化。结果1）鼠胚脑皮质在无血清悬浮培养形成大量神经球,并可传代,球内细胞均表达 nestin。分化培养,可检测出MAP2或GFAP阳性细胞。2）EPO≥5u/ml各组分化培养,表达MAP2阳性细胞显著升高（P＜0．05）。结论大鼠胚胎脑皮质体外培养可获得NSCs ;适当浓度EPO可提高NSCs向神经元的分化。     

GFP转基因鼠神经上皮干细胞纹状体内移植的实验研究

目的：观察GFP转基因鼠胚胎神经上皮干细胞的体外培养及脑内移植后的存活与分化状况。 方法：将GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞置于无血清培养基内纯化扩增,用巢蛋白免疫组织化学染色鉴定神经干细胞,将扩增后的含GFP基因的神经干细胞在立体定位仪下,定向移植到大鼠的纹状体内。术后不同时期取材、切片,在荧光显微镜下观察移植细胞的存活状况,行微管相关蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色鉴定移植细胞的分化状况。结果： GFP转基因鼠神经管来源的神经上皮干细胞在无血清培养基内能增殖形成神经球,呈巢蛋白阳性。纹状体内移植2周、4周均可见明显的呈绿色荧光的移植细胞,显示细胞存活良好。免疫组织化学染色显示移植细胞在不同间隔时间可分化为MAP-2、GFAP及TH阳性细胞。结论： GFP转基因鼠来源的具有GFP标记的胚胎神经上皮干细胞可在体外培养扩增,移植到大鼠纹状体内存活良好并能分化成神经元、神经胶质细胞,且能定向分化为多巴胺能神经元。     

大鼠海马中56KD、83KD蛋白诱导神经干细胞向神经元分化的协同作用研究

目的:探讨切割海马伞大鼠海马中56KD、83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面是否具有协同作用.方法:切割海马伞后的海马进行非变件聚丙烯酰胺凝胶电泳,墩低分子量区的56KD、65KD和83KD 3条差异蛋白条带电洗脱后以不同的组合加入鼠胚神经干细胞的分化培养液中诱导神经干细胞分化,12天后行MAP-2免疫荧光染色,记数其中MAP-2阳性神经元数,胞体面积和细胞周长.用STATA7.0软件进行方差分析和两两比较.结果:56KD 65KD 83KD组和56KD 83KD组MAP-2神经元的数量是47.1±9.64,43.7±8.41,胞体大,突起丰富:65KD 83KD组、56KD 65KD组、56KD组和83KD组MAP-2神经元的胞体较小,突起较矩:65KD组和对照组的神经元胞体最小,突起最短.MAP-2神经元的数量、面积和周长统计分析结果显示:56KD 65KD 83KD组和56KD 83KD组与其他6组均有显著性差异.56KD 65KD 83KD组和56KD 83KD组之间没有显著性差异:65KD 83KD组、56KD 65KD组、56KD组和83KD组四组之间没有显著性差异,但是它们与65KD组和对照组均有显著性差异,65KD组和对照组之间没有显著性差异.结论:56KD、83KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面具有协同作用.     

Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation on adenosine triphosphate content and microtubule associated protein-2 expression after cerebral ischemia-reperfusion injury in rat brain

Background Repetitive transcranial magnetic stimulation （rTMS） research has mainly been focused on the therapeutic effect of psychiatric disorders and Parkinson＇s disease. A few studies have shown that rTMS might protect against delayed neuronal death induced by transient ischemia, enhance long-term potentiation in ischemic conditions and affect regional brain blood flow and metabolism. The aim of this study was to determine the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation （rTMS） on adenosine triphosphate （ATP） content and microtubule associated protein-2 （MAP-2） expression in rat brain after middle cerebral artery occlusion （MCAO）/reperfusion. Methods To study the effects of different timecourses of rTMS on ATP content and MAP-2 expression, 90 rats were randomly divided into three groups （30 rats in each group）. To study the effects of multiple rTMS parameters on ATP content and MAP-2 expression, the rats in each group were further divided into six subgroups （five rats each）. The rats were sacrificed at 1-hour, 24-hour and 48-hour intervals after reperfusion, and the brain tissues were collected for the detection of ATP and MAP-2.
Results rTMS could significantly increase ATP content and MAP-2 expression in the left brain following ischemic insult （P 〈0.01） and different rTMS parameters had different effects on the ATP level and the MAP-2 expression in the left striatum. A high-frequency rTMS played an important role in MAP-2 expression and ATP preservation.
Conclusions This study revealed that rTMS induced significant increase of ATP content and MAP-2 expression in the injured area of the brain, suggesting that the regulation of both ATP and MAP-2 may be involved in the biological mechanism of the effect of rTMS on neural recovery. Therefore, rTMS may become a potential adjunctive therapy for ischemic cerebrovascular disease.     

CM-Dil体外标记骨髓间充质干细胞及其在烧伤大鼠模型肠组织内的示踪

目的：探讨氯甲基苯甲酰胺（CM-Dil）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外标记及其在烧伤大鼠模型肠组织内的示踪能力。方法：采用贴壁培养法分离、纯化、扩增BMSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子（EGF）和维甲酸（RA）诱导BMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测神经元表面标志神经细胞特异性标志微管相关蛋白-2（MAP-2）和神经元特异核蛋白（NeuN）的表达。4、6和8 mg•L^-1 CM-Dil标记BMSCs,CCK-8法检测不同浓度CM-Dil对细胞的毒性作用,流式细胞仪检测其标记率。选用成年雄性Wistar大鼠,制备烧伤大鼠模型,经球后静脉注射1×107个CM-Dil标记的BMSCs。大鼠烧伤2周及6个月后取肠组织,制备冰冻切片,用激光共聚焦显微镜观察BMSCs在大鼠肠组织内的定植情况。结果：免疫细胞化学结果表明,BMSCs 诱导分化的神经元样细胞表达NeuN和MAP-2。CCK-8法结果表明,8 mg•L ^-1 CM-Dil组细胞毒性显著高于对照组（P<0.05）,4和6 mg•L^-1 CM-Dil与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 mg•L^-1 CM-Dil标记BMSCs对细胞无毒性,标记率达93.9%,细胞形态无改变。冰冻切片激光共聚焦显微镜观察,CM-Dil标记的BMSCs在大鼠烧伤后2周及6个月的肠组织内定植。结论：CM-Dil可以体外标记BMSCs,可以用于BMSCs在烧伤大鼠模型肠组织组织内的示踪研究。     

新生大鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养与胆碱能神经元的鉴定

目的:体外分离和培养新生大鼠大脑皮质神经干细胞并进行鉴定,为用于脑梗死动物模型梗死区移植细胞作准备.方法:分离新生大鼠皮质神经干细胞,进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的特性进行鉴定,并对细胞的胆碱能特征进行鉴定.结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞,其分化后可获得MAP-2、GFAP和 CNPase阳性的神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞;通过胆碱能鉴定发现大脑皮质干细胞可分化为胆碱能神经元. 结论:体外分离和培养的大脑皮质神经干细胞具有增殖分化的能力,并可以分化为胆碱能神经元,有望应用于皮质损伤后认知障碍及运动障碍的细胞移植治疗.