丹酚酸F调控Bax/Caspase-3/GSDME信号通路改善肾小管上皮细胞焦亡作用机制

目的 基于B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）/胱天蛋白酶-3（Caspase-3）/消皮素E（GSDME）通路探讨丹酚酸F改善高糖诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）损伤的机制。方法 细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测不同浓度（2.5、5、10、20 μmol·L^-1）丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞相对活力的影响及给予丹酚酸F不同干预时间条件下HK-2细胞的相对活力;乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒和酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒分别检测细胞培养基上清中LDH和白细胞介素-1β（IL-1β）的含量;流式细胞术结合异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）和Hoechst 33342/PI染色检测丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞PI阳性率的影响;蛋白免疫印迹法（Western blot）评价丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中Bax、Bcl-2、细胞色素C（Cyt C）、胱天蛋白酶-9（Caspase-9）、Caspase-3、GSDME蛋白表达及激活情况的影响。2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法（DCFH-DA）及线粒体膜电位（JC-1）考察丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中活性氧（ROS）产生及线粒体膜电位的影响。结果 与空白组比较,模型组细胞活力显著降低（P<0.01）,乳酸脱氢酶、炎症因子IL-1β、PI阳性细胞比例均显著升高（P<0.01）;Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达显著升高（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达显著降低（P<0.01）,HK-2细胞线粒体膜电位的降低,ROS产生过量蓄积。与模型组比较,丹酚酸F组有效改善高糖诱导所致HK-2细胞的损伤（P<0.05）,明显降低细胞培养基上清中LDH及IL-1β含量（P<0.05,P<0.01）,显著减少PI阳性细胞的比例（P<0.01）;丹酚酸F组降低Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达,明显升高Bcl-2蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,HK-2细胞线粒体膜电位的升高,ROS的过量蓄积减少。结论 丹酚酸F通过减少ROS的产生,改善线粒体膜电位失衡,抑制Bax/Caspase-3/GSDME信号通路介导的细胞焦亡发挥改善高糖诱导所致HK-2细胞损伤的作用。     

温经汤对子宫内膜异位症患者异位内膜间质细胞HIF-1α表达及线粒体功能的调控作用

目的 从调控低氧应激及线粒体功能角度探讨温经汤防治子宫内膜异位症（EMT）的作用机制。方法 采用消化法原代培养EMT患者异位子宫内膜间质细胞（ESCs），实验设正常（Control）组、5%空白血清（5% KBXQ）组、10%空白血清（10% KBXQ）组、5%温经汤血清（5% WJTXQ）组、10%温经汤血清（10% WJTXQ）组。噻唑蓝（MTT）比色法检测不同组ESCs增殖情况，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA及蛋白表达，透射电镜观察ESCs线粒体超微结构，高内涵分析（HCS）法多参数同时检测细胞线粒体功能［线粒体膜电位，线粒体膜电位（MMP）和细胞色素C（Cyt C）表达］及细胞凋亡情况（细胞膜通透性、细胞核荧光强度、细胞核大小及细胞数量），流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax），Bcl-2和剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved Caspase-3）蛋白表达。结果 与Control组比较，5% KBXQ和10% KBXQ组细胞活力显著增加（P<0.01）；HIF-1α mRNA及蛋白表达水平无明显变化；透射电镜观察可见线粒体嵴明显，线粒体内外膜清晰；HCS多通道荧光染色显示，MMP及Cyt C表达、细胞膜通透性无显著变化，细胞核呈现均匀淡染；细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达及Bax/Bcl-2值均无明显变化。与Control组及相应体积分数KBXQ组比较，5% WJTXQ及10% WJTXQ组细胞活力显著下降（P<0.01）；HIF-1α mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.05，P<0.01）；线粒体超微结构破坏，部分线粒体肿胀，嵴模糊；MMP显著降低，Cyt C释放量明显增加（P<0.05，P<0.01）；细胞膜通透性显著增加（P<0.01），并可观察到核固缩、核内DNA凝集、细胞数量下降等凋亡特征（P<0.05，P<0.01）；流式细胞术结果显示，细胞凋亡率显著升高（P<0.01），与HCS分析结果一致；且cleaved Caspase-3蛋白表达水平及Bax/Bcl-2值明显升高（P<0.05，P<0.01）。结论 温经汤能够下调异位ESCs中HIF-1α表达而改善低氧应激，抑制细胞增殖，降低线粒体生物活性，诱导细胞凋亡，这可能是其防治EMT的作用机制。     

抗纤益心方干预线粒体通透性转换孔抑制心肌细胞凋亡的机制

目的 探讨抗纤益心方通过调控线粒体通透性转换孔（mPTP）对心肌细胞凋亡的影响及相关作用机制。方法 H9c2心肌细胞常规培养，饥饿8 h后分为正常组，模型组，抗纤益心方（0.25 g·L^-1）组，环孢素A（10 μmol·L^-1）组，药物作用24 h用于后续实验。利用去甲肾上腺素（NE）诱导H9c2心肌细胞肥大模型，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测NE的最佳造模浓度，流式细胞仪检测mPTP的开放程度，同时检测mPTP开放后引起的凋亡相关因子Cyp-D，Cyt-C，Caspase-3 mRNA和蛋白的表达水平，和线粒体膜电位的水平。结果 NE浓度在200 μmol·L^-1时心房钠尿肽（ANP），脑钠肽（BNP） mRNA的表达水平最高，此浓度作为诱导H9c2心机细胞肥大模型的最佳浓度，与正常组比较，模型组mPTP过度开放，线粒体内相对荧光强度减弱和线粒体膜电位降低（P<0.05，P<0.01）；凋亡相关因子Cyp-D，Cyt-C，Caspase-3 mRNA和蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组比较，抗纤益心方组和环孢素A组mPTP开放受到抑制，线粒体相对荧光强度和线粒体膜电位升高（P<0.05，P<0.01）；Cyp-D，Cy-tC，Caspase-3 mRNA和蛋白表达降低（P<0.05）。结论 抗纤益心方能够抑制心肌细胞凋亡，其作用机制可能是通过调控mPTP的开放，抑制相关凋亡因子Cyp-D，Cyt-C，Caspase-3的表达有关。     

大柴胡汤通过CREB/PGC-1α通路保护营养型肥胖大鼠肝脏粒体功能

目的 观察大柴胡汤对营养型肥胖大鼠环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子α（PGC-1α）通路的作用及肝脏线粒体的保护机制。方法 8周龄SD雄性大鼠120只,随机分为正常组20只和造模组100只。正常组给予大鼠维持饲料喂养,造模组给予高脂饲料喂养。造模成功大鼠随机分为模型组、阳性药（二甲双胍）组、大柴胡汤低、中、高剂量组（4.25,8.5,17 g·kg^-1）,每组20只。电子天平称取并比较各组大鼠体质量,计算Lee''s指数,分光光度法检测肝脏线粒体膜电位,电镜检测线粒体超微结构,蛋白免疫印迹法检测PGC-1α蛋白表达和CREB磷酸化作用。结果 与正常组比较,模型组大鼠体质量及Lee''s指数显著增加（P<0.01）,线粒体膜电位显著下降,PGC-1α蛋白表达和CREB磷酸化水平显著下降（P<0.01）;与模型组比较,大柴胡汤能够明显降低肥胖大鼠体质量和Lee''s指数（P<0.05,P<0.01）,提高肝脏线粒体膜电位（P<0.05,P<0.01）和保护线粒体结构完整性,上调PGC-1α蛋白表达和促进CREB磷酸化（P<0.05,P<0.01）。结论 大柴胡汤激活CREB/PGC-1α通路,保护线粒体结构与功能,有效抑制肥胖大鼠体质量增加。     

脑心安胶囊激活CREB/PGC-1α改善慢性脑缺血致VCI大鼠线粒体及氧化损伤的作用机制

目的 以慢性脑缺血致血管性认知障碍（VCI）大鼠为模型，探究脑心安胶囊对VCI大鼠脑组织线粒体功能障碍及其导致的氧化损伤的保护作用。方法 150只大鼠采用随机数字法分为造模组（130只）和假手术组（20只），以双侧颈动脉结扎法（2-VO）造模，制成慢性脑缺血大鼠模型。经筛选，将造模组中VCI造模成功的87只大鼠，随机分为模型组、阳性药组（安理申，0.5 mg·kg^-1），脑心安胶囊低、中、高剂量组（0.18、0.36、0.72 g·kg^-1），每组17~18只大鼠。经灌胃给予脑心安胶囊8周后，采用大鼠新物体识别和Y迷宫实验测定脑心安胶囊对VCI大鼠学习记忆和工作记忆的影响。以免疫荧光染色法测定大鼠脑组织8-氧鸟嘌呤（8-OxoG）含量，分光光度法测定大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性、线粒体的肿胀度、线粒体膜电位、丙酮酸脱氢酶（PDH）和α-酮戊二酸脱氢酶（KGDH）活性，电镜观察大鼠脑组织线粒体亚显微结构，蛋白免疫印迹法（Western blot）测定脑组织环磷腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）磷酸化水平和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α（PGC-1α）、核呼吸因子-1（NRF-1）和线粒体转录因子A（mt-TFA）蛋白表达水平，光化学法测定大鼠线粒体状态Ⅳ H₂O₂生成和脑内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）水平。结果 与假手术组比较，模型组大鼠新物体辨别指数和Y迷宫自发交替反应率显著下降（P<0.01），脑组织ROS生成量明显增加（P<0.01），线粒体膜电位和肿胀度A值显著下降（P<0.01），线粒体明显肿胀，电镜观察显示脑组织线粒体出现显著的空泡、嵴断裂等亚显微结构结构损伤，CREB磷酸化水平和PGC-1α、NRF-1和mt-TFA蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），脑组织中PDH、KGDH活性和线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性均明显下降（P<0.01），线粒体状态Ⅳ H₂O₂生成显著增加（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.01），SOD及GSH-Px活性均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，脑心安胶囊各剂量均能够明显提高VCI大鼠新物体辨别指数（P<0.05，P<0.01）和自发交替反应率（P<0.05，P<0.01），减少脑组织ROS生成量（P<0.01），提高线粒体膜电位和肿胀度A值（P<0.05，P<0.01），减少线粒体肿胀程度和线粒体亚显微结构损伤，提高CREB磷酸化水平和上调PGC-1α、NRF-1和mt-TFA蛋白表达（P<0.05，P<0.01），提高PDH、KGDH和线粒体呼吸链复合物Ⅲ、Ⅳ的活性（P<0.01），降低线粒体状态Ⅳ H₂O₂生成量（P<0.01），降低MDA含量（P<0.05，P<0.01），提高SOD及GSH-Px活性（P<0.01）。结论 脑心安胶囊通过激活CREB/PGC-1α通路，保护线粒体结构、功能，提高机体抗氧化能力，抑制慢性脑缺血诱导的线粒体功能障碍及其氧化损伤，改善慢性脑缺血导致的大鼠血管性认知障碍。     

哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用

目的 研究哈蟆油蛋白酶解物（ORPH）对乙醇诱导的L-02细胞损伤相关通路蛋白表达影响的作用机制研究。方法 复合酶解法制备ORPH,以400 mmol·L^-1乙醇建立L-02肝细胞损伤模型,细胞增殖与活性检测试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化,JC-1/Hochest染色观察形态学变化;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路及细胞焦亡相关蛋白在L-02肝细胞中的表达变化,研究ORPH对乙醇所致肝细胞损伤的保护作用及机制。结果 CCK-8法结果表明400 mmol·L^-1乙醇可在12 h内明显引起L-02肝细胞损伤;与空白组比较,模型组L-02细胞活力显著下降（P<0.01）,细胞处于G₀/G₁期的细胞占比显著升高（P<0.01）,细胞总凋亡率显著升高（P<0.01）,线粒体膜电位下降;B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）,细胞色素C（Cyt C）,半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）凋亡相关蛋白的表达明显升高（P<0.05,P<0.01）,MAPK信号通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶（JNK）,p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）明显上调（P<0.05,P<0.01）,且焦亡蛋白Caspase-1,白细胞介素-1β（IL-1β）表达明显增强（P<0.05）,Bcl-2显著下降（P<0.01）;与模型组比较,ORPH处理组细胞周期阻滞有所改善（P<0.05,P<0.01）,细胞总凋亡率显著下降（P<0.01）,线粒体膜电位升高,呈剂量相关性;Bax,Cyt C,Caspase-3蛋白表达明显降低（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2蛋白表达升高（P<0.05,P<0.01）,MAPK信号通路相关蛋白及焦亡相关蛋白表达均呈下降趋势（P<0.05,P<0.01）。结论 ORPH可通过抑制乙醇诱导L-02肝细胞引起的氧化应激肝细胞损伤,改善恢复线粒体膜电位,降低线粒体介导的细胞凋亡通路蛋白的表达,并抑制MAPK信号通路相关蛋白、焦亡通路相关蛋白表达,从而降低乙醇诱导L-02肝细胞的线粒体功能障碍及炎症反应并减轻氧化应激,对酒精性肝损伤起到治疗作用。     

六味地黄丸对秀丽隐杆线虫AD模型线粒体损伤的保护作用

目的 探讨六味地黄丸提取物对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）阿尔茨海默病（AD）模型线粒体损伤的保护作用。方法 使用转染人源β淀粉样蛋白（Aβ）_1-42基因的秀丽隐杆线虫为AD模型，实验设空白组、模型组、二甲双胍组（50 mmol·L^-1）及六味地黄丸低、中、高剂量组（1.04、2.08、4.16 g·kg^-1）。行为学方法观察线虫5-羟色胺（5-HT）的敏感性，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测线虫体内Aβ表达，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）试剂盒检测线虫体内总ATP含量，线粒体膜电位检测试剂盒法（JC-1法）检测线粒体膜电位，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测Aβ表达基因（Amy-1），超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、线粒体转录因子A同源高迁移率族蛋白-5（HMG-5）、线粒体动力相关蛋白1（DRP1）、线粒体分裂蛋白1（FIS1）mRNA的表达。结果 六味地黄丸提取物能够降低AD模型线虫对外源5-HT的超敏感性（P<0.05），延缓AD模型线虫神经元中由于Aβ过度表达所引起的对外源性5-HT超敏感性的AD样病理特征；与空白组比较，模型组Aβ蛋白和Amy-1 mRNA的表达升高（P<0.01），SOD-1与HMG-5 mRNA表达下降（P<0.01），DRP1与FIS1 mRNA表达升高（P<0.01），线粒体膜电位水平下降（P<0.05），ATP含量下降（P<0.01）；与模型组比较，二甲双胍组、六味地黄丸中、高剂量组Aβ蛋白和Amy-1 mRNA的表达明显降低（P<0.05，P<0.01），SOD-1与HMG-5 mRNA表达显著升高（P<0.01），DRP1 mRNA表达降低（P<0.05，P<0.01），FIS1 mRNA表达降低（P<0.01），线粒体膜电位水平升高（P<0.01），ATP含量升高（P<0.05，P<0.01）。结论 六味地黄丸提取物可能通过增强线粒体抗氧化能力，保护线粒体DNA，减少线粒体分裂碎片化，修复受损的线粒体，回调线粒体膜电位，恢复神经元ATP水平，减轻Aβ沉积导致的神经元损伤。     

酸枣仁汤对老年慢性快动眼睡眠剥夺模型大鼠中枢下丘脑线粒体损伤及细胞凋亡的影响

目的 探讨酸枣仁汤对线粒体介导的神经细胞凋亡的影响。方法 将50只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、舒乐安定组（0.18 mg·kg^-1·d^-1），酸枣仁汤低、高剂量组（6.48，12.96 g·kg^-1·d^-1），除正常组外，其余各组均皮下注射D-半乳糖，于末次给药后进行多平台水环境睡眠剥夺，造模结束后各组开始灌胃给药，连续给药7 d。采用透射电镜观察中枢下丘脑线粒体形态，采用分光光度法检测检测中枢下丘脑中Na⁺-K⁺-三磷酸腺苷（ATP）酶，Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测中枢下丘脑细胞色素C（Cyt C），B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2），Bcl-2相关X蛋白（Bax）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）蛋白表达水平的改变。结果 正常组线粒体未见明显病理改变，大小适中，形态多呈椭圆或梭形，嵴排列较整齐。与正常组比较，模型组线粒体形态异常，线粒体发生明显肿胀并且伴有空泡化，出现了“髓鞘样”，嵴发生断裂且数量减少；与模型组比较，舒乐安定组、酸枣仁汤高剂量组线粒体损伤减轻，空泡化现象减少，部分嵴断裂，并未出现明显肿胀，其中酸枣仁汤高剂量组改善较为明显。与正常组比较，模型组Na⁺-K⁺-ATP，Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性显著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.01），Cyt C，Bax，Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，舒乐安定组、酸枣仁汤高剂量组Na⁺-K⁺-ATP，Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性均显著升高（P<0.01），舒乐安定组、酸枣仁汤高剂量组Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.01），Cyt C，Bax，Caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.05，P<0.01），酸枣仁汤低剂量组Na⁺-K⁺-ATP酶活性显著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05），Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 酸枣仁汤可以改善下丘脑神经细胞线粒体功能，抑制神经细胞凋亡。     

苓桂术甘汤对心梗后慢性心衰大鼠线粒体分裂-融合及Sirt3/AMPK信号通路的影响

目的 探讨苓桂术甘汤对心肌梗死（MI）后慢性心力衰竭（CHF）大鼠线粒体分裂-融合及沉默信息调节因子3（Sirt3）/单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组（生理盐水，仅穿线不结扎）、模型组（生理盐水，结扎冠状动脉左前降支近心端）、苓桂术甘汤组（4.2 g·kg^-1）、卡托普利组（0.002 57 g·kg^-1），每组10只，连续给药28 d。彩色多普勒超声成像仪检测大鼠心功能参数变化；苏木素-伊红（HE）染色观察心脏病理学改变；免疫荧光法检测活性氧（ROS）水平；JC-1法检测线粒体膜电位；比色法检测三磷酸腺苷（ATP）水平、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、线粒体呼吸链复合物活性（Ⅰ~Ⅳ）；原位末端标记法（TUNEL）染色检测心肌组织细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Sirt3、磷酸化（p）-AMPK、磷酸化动力相关蛋白1（p-Drp1）、线粒体分裂蛋白1（Fis1）、线粒体分裂因子（MFF）、视神经萎缩蛋白1（OPA1）蛋白表达水平。结果 与假手术组比较，模型组大鼠左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）显著升高（P<0.01），左室短轴缩短率（LVFS）、左室射血分数（LVEF）显著降低（P<0.01）；心肌组织出现炎性细胞浸润，病理损伤明显，ROS、MDA水平与心肌细胞凋亡率显著升高（P<0.01），SOD水平、ATP含量、膜电位显著降低（P<0.01）；线粒体呼吸链复合物活性（Ⅰ~Ⅳ）显著降低（P<0.01）；p-Drp1、Fis1、MFF蛋白水平显著上调（P<0.01），Sirt3、p-AMPK、OPA1蛋白水平显著下调（P<0.01）。与模型组比较，苓桂术甘汤组与卡托普利组LVIDd和LVIDs显著降低（P<0.01），LVEF和LVFS显著升高（P<0.01），心肌组织炎性细胞浸润与病理损伤明显减轻，ROS、MDA水平与心肌细胞凋亡率显著降低（P<0.01），SOD水平、ATP含量、膜电位显著升高（P<0.01）；线粒体呼吸链复合物活性（Ⅰ~Ⅳ）显著升高（P<0.01）；p-Drp1、Fis1、MFF蛋白表达显著下调（P<0.01），Sirt3、p-AMPK、OPA1蛋白表达显著上调（P<0.01）。结论 苓桂术甘汤可缓解心肌细胞氧化应激与细胞凋亡损伤，改善线粒体功能，其作用可能与线粒体分裂-融合、Sirt3/AMPK信号通路有关。     

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD炎性焦亡途径探讨参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠的作用机制

目的 探讨参芪抑瘤方干预细胞焦亡在抗肿瘤效应中的作用机制。方法 随机抽取10只BALB/c小鼠（雄性）作为正常组,余40只建立肝癌小鼠异位移植瘤模型,建模5 d后随机分为模型组、顺铂组［2.5×10^-3 g·kg^-1·（3 d）^-1］、参芪抑瘤方组（27 g·kg^-1·d^-1）、联合组（参芪抑瘤方+顺铂）。正常组与模型组以等量生理盐水灌胃,连续干预10 d,观察各组小鼠一般情况,干预结束后,称量小鼠瘤体质量,计算抑瘤率,采用苏木素-伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理变化;检测小鼠肝功能指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平;原位末端标记法（TUNEL）检测小鼠肿瘤组织细胞DNA损伤情况;免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测瘤组织中NOD样受体蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）、消皮素D（GSDMD）蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测瘤组织中白细胞介素（IL）-1β和IL-18的含量。结果 与正常组比较,模型组小鼠精神状态差,倦卧懒动,毛色暗淡;肝功能检测血清ALT、AST水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较,各给药组小鼠精神状态明显好转,且各给药组均可不同程度抑制瘤体生长,肿瘤质量均下降,其中联合组抑瘤率最强（P<0.01）;HE染色示,模型组小鼠肿瘤组织病理形态学病变显著,各给药组均有一定程度改善,以参芪抑瘤方组及联合组细胞核,溶解破裂更为明显;肝功能检测中,参芪抑瘤方组及联合组小鼠血清ALT、AST水平均下降显著（P<0.01）;各给药组炎症因子IL-1β和IL-18均下降（P<0.05,P<0.01）;TUNEL染色示各给药组干预后TUNEL染色阳性降低（P<0.05,P<0.01）,以顺铂组和参芪抑瘤方组降低显著（P<0.01）;Western blot、免疫组化、免疫荧光在肿瘤组织中检测发现,各给药组NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均下降（P<0.05,P<0.01）。与顺铂组比较,参芪抑瘤方组和联合组小鼠精神状态佳,瘤体形态规则,联合组小鼠肿瘤质量下降（P<0.05）;参芪抑瘤方组ALT和AST水平下降（P<0.05）;参芪抑瘤方组和联合组IL-1β和IL-18均下降（P<0.05,P<0.01）,以联合组最为明显（P<0.01）;免疫组化结果显示,联合组小鼠肿瘤组织中GSDMD蛋白表达显著降低（P<0.01）;免疫荧光检测发现参芪抑瘤方组NLRP3在肿瘤组织中表达显著降低（P<0.01）;Western blot结果显示参芪抑瘤方组及联合组NLRP3蛋白表达水平下降显著（P<0.01）,联合组Caspase-1蛋白表达水平下降显著（P<0.01）;GSDMD蛋白表达下降不明显,差异无统计学意义。结论 参芪抑瘤方联合顺铂具有明显抑瘤作用,其抗肿瘤作用可能是通过下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD炎性焦亡途径抑制细胞焦亡,缓解肝癌小鼠的炎症反应,达到抗肿瘤的作用。     

益气养阴方及其拆方对急性髓系白血病细胞细胞凋亡及Cyt-C,Apaf-1,Smac/Diablo,AIF表达的影响

目的:研究益气养阴方及其拆方后的扶正方、祛邪方对人急性髓系白血病细胞凋亡及细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C),凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1),第二个线粒体衍生的半胱天冬蛋白酶激活因子(the second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-blinding protein with low PI,Smac/Diablo),凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factors,AIF)表达的影响,探讨益气养阴方治疗白血病的可能作用机制。方法:采用NOD/SCID小鼠,以KG-1a细胞株建立人急性髓系白血病模型,随机分为全方组、祛邪组、扶正组和空白组,取NOD/SCID小鼠脾细胞制成细胞悬液,应用流式细胞术检测NOD/SCID小鼠细胞凋亡率;采用免疫组化法检测NOD/SCID小鼠骨髓中线粒体相关凋亡因子CytC,Apaf-1,Smac/Diablo和AIF的表达。结果:用药后,用药组小鼠生存时间较空白组显著延长(P0.01),全方组小鼠生存时间较扶正组与祛邪组显著延长(P0.01),祛邪组小鼠生存时间较扶正组显著延长(P0.01)。用药组细胞凋亡率较空白组明显升高(P0.01),全方组较扶正组与祛邪组显著升高(P0.01),祛邪组较扶正组显著升高(P0.01)。用药组小鼠骨髓中Cyt-C,Apaf-1,Smac/Diablo,AIF的表达较空白组显著升高(P0.05),其中Cyt-C与Apaf-1表达显著升高(P0.01);全方组均高于扶正组与祛邪组(P0.01);祛邪组较扶正组均升高(P0.05),Cyt-C,Apaf-1和Smac/Diablo表达显著升高(P0.01)。其中对于各指标的影响全方组均优于扶正组与祛邪组,祛邪组均优于扶正组。结论:益气养阴方能够提高NOD/SCID小鼠的细胞凋亡率,上调线粒体相关凋亡因子Cyt-C,Apaf-1,Smac/Diablo,AIF的表达,并诱导其凋亡,抑制白血病细胞增殖,其机制可能与线粒体凋亡通路有关。     

人参糖蛋白对阿霉素所致心肌毒性的保护作用及其机制研究

目的通过体内外实验,探讨人参糖蛋白对阿霉素心脏毒性的保护作用及机制。方法建立SD大鼠心肌损伤模型,给予人参糖蛋白进行干预后,检测血清中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶MB(creatinekinase isoenzymes-MB,CK-MB)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠心肌组织病理变化。建立心肌细胞H9c2损伤模型,采用CCK-8法检测H9c2细胞活力;通过流式细胞术检测H9c2细胞周期、细胞凋亡、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位变化;采用Western blotting法检测H9c2细胞凋亡相关蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关蛋白、沉默信息调节因子2相关酶类3(silent mating type information regulation 2 homolog 3,Sirt3)的表达情况。结果心肌损伤大鼠模型中,模型组大鼠心肌纤维排列紊乱,肌纤维严重变性,LDH和CK-MB活性显著升高(P0.01),SOD活性和GSH水平显著降低(P0.05、0.01);与模型组比较,人参糖蛋白高剂量组心肌肌束排列较为整齐,LDH和CK-MB活性显著下降(P0.05),GSH水平显著升高(P0.05),人参糖蛋白对阿霉素所致的心肌组织病理学损伤有明显修复作用。细胞损伤模型中,模型组细胞存活率显著下降(P0.001),细胞周期阻滞于G1期(P0.01),细胞凋亡显著升高(P0.01),ROS水平显著升高(P0.01),线粒体膜电位显著下降(P0.01),Sirt3、Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达水平显著降低(P0.01),Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)蛋白表达水平显著升高(P0.05、0.01);与模型组比较,人参糖蛋白组细胞存活率显著升高(P0.05、0.01),细胞增殖周期恢复,细胞凋亡率显著降低(P0.05),ROS水平显著降低(P0.05),线粒体膜电位显著升高(P0.05),Sirt3、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05),Bax、Cyt C、JNK、p38、ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P0.05)。结论人参糖蛋白能够通过抗氧化应激、降低线粒体膜电位、提高H9c2细胞内ROS水平并调控MAPK信号通路抑制细胞凋亡,从而保护阿霉素诱导的心肌损伤。     

参芪扶正注射液对结肠癌小鼠恶液质后骨骼肌线粒体功能的影响

目的 探讨结肠癌恶液质小鼠骨骼肌中线粒体功能变化及参芪扶正注射液干预后的影响。方法 将40只雌性BLAB/c裸鼠随机分为对照组、模型组及参芪扶正注射液低、高剂量组,每组10只。除对照组外,其余各组均ip人结肠癌Lovo细胞,并饲养至肿瘤广泛转移,制备癌症恶液质动物模型;根据消瘦程度和体质量变化监测各组小鼠癌症恶液质状态,ip给予参芪扶正注射液低、高剂量,每3天给药1次,连续给药7次。21 d后观察小鼠体质量变化,检测腓肠肌中三磷酸腺苷（ATP）、丙二醛（MDA）水平;Western blotting法检测小鼠腓肠肌中线粒体相关蛋白4-羟基壬烯酸（4HNE）、PPARγ共激活因子-1（PGC-1）、电压依赖型阴离子孔道蛋白（VDAC1）的表达情况。结果 与对照组比较,模型组与参芪扶正注射液干预组小鼠均出现癌症恶液质状态;与对照组比较,模型组小鼠腓肠肌ATP水平下降,MDA合成增多,腓肠肌线粒体相关蛋白4HNE和PGC-1表达水平均升高（P<0.05）,VDAC1表达无明显差异;与模型组比较,参芪扶正注射液组小鼠腓肠肌ATP水平升高,MDA合成减少,腓肠肌线粒体相关蛋白4HNE和PGC-1表达水平均降低（P<0.05）,VDAC1表达亦无明显差异。结论 参芪扶正注射液可以明显改善结肠癌腹腔转移小鼠的恶液质状态,可能与调节腓肠肌中线粒体功能、减轻线粒体氧化损伤有关。     

槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞大鼠脑细胞的作用及机制研究

目的探究槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)大鼠脑细胞的作用及机制。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组和槐定碱低、中、高剂量(2.5、5.0、10.0mg/kg)组,给予槐定碱5d后,建立p MCAO大鼠模型。考察槐定碱对pMCAO大鼠神经功能评分的影响;考察槐定碱对pMCAO大鼠脑梗死率的影响;采用流式细胞术检测各组大鼠缺血半暗带区细胞凋亡率;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组大鼠脑组织病理变化;采用Western blotting法考察各组大鼠脑组织B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated Xprotein,Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达情况。结果与模型组比较,槐定碱组大鼠神经缺陷症状改善,脑梗死率显著降低(P0.05、0.01),缺血半暗带细胞凋亡率明显降低(P0.05、0.01),脑组织损伤有所改善,脑组织Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低(P0.05、0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05、0.01)。结论槐定碱对pMCAO大鼠脑细胞具有保护作用,其机制可能与上调Bcl-2及下调Bax、Caspase-3蛋白表达水平,进而抑制细胞凋亡有关。     

肝豆汤改良方对Wilson's病模型TX乳鼠神经元内Cyt C/Caspase信号通路的分子调控机制

目的:探讨肝豆汤改良方调控TX乳鼠神经元内细胞色素C(Cyt C)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)信号通路的分子靶点并观察其相应的调控机制。方法:本实验乳鼠神经元通过原代方法分离培养所得,分为正常组、模型组、肝豆汤改良方组、丁苯酞组,正常组为正常DL乳鼠神经元,用完全培养基培养,模型组为TX乳鼠神经元,用10%空白兔血清培养,肝豆汤改良方组为TX乳鼠神经元,加入含体积浓度(5%,10%,15%,20%)肝豆汤改良方兔血清的培养基继续培养,丁苯酞组为TX乳鼠神经元,用10%含丁苯酞兔血清培养。采用原子吸收分光光度法检测不同浓度含肝豆汤改良方兔血清作用24 h后,对TX乳鼠神经元内微量元素的影响;流式细胞仪检测经肝豆汤改良方兔血清作用后活性氧(ROS)释放量的变化;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测经含肝豆汤改良方兔血清作用后Cyt C,Caspase-9,Caspase-3蛋白的表达。结果:与模型组比较,含肝豆汤改良方兔血清可显著降低TX乳鼠神经元内铜、铁含量,增加锌含量(P0.01)。流式细胞仪检测发现,含肝豆汤改良方兔血清较模型组可显著降低TX乳鼠神经元内ROS的释放量(P0.01)。Western blot检测结果显示与模型组比较,含肝豆汤改良方兔血清可显著降低TX乳鼠神经元内Cyt C,Caspase-9,Caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:肝豆汤改良方可能是通过促进过量铜排出而抑制神经元内Cyt C,Caspase-9,Caspase-3表达,从而减轻高铜对神经元的损伤作用。肝豆汤改良方可通过减少脑内铜含量,进而调控Cyt C/Caspase信号通路达到减轻高铜诱导的神经元损伤的治疗效果。     

忍冬藤提取物诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用及机制研究

目的研究忍冬藤Lonicerajaponica提取物对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的作用及机制。方法采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF/MS)表征忍冬藤提取物的化学成分;采用MTT法检测忍冬藤提取物对人骨肉瘤细胞HOS、143B以及人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2存活率的影响;采用荧光显微镜观察忍冬藤提取物对HOS、143B细胞凋亡的影响;采用Annexin V/PI双染法检测忍冬藤提取物对HOS细胞凋亡的影响;采用JC-1染色法检测忍冬藤提取物对HOS细胞线粒体膜电位的影响;采用Westernblotting法检测忍冬藤提取物对HOS细胞B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(bcl-2associated X,Bax)、B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、活化的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleavedpolyADP-ribosepolymerases,cleavedPARP)、cleavedCaspase-9和细胞色素C(cytochrome-c,Cyt-C)蛋白表达的影响。结果忍冬藤提取物中鉴定出有机酸类、三萜皂苷类、黄酮类、环烯醚萜类和氨基酸类5种类型的36种化学成分。忍冬藤提取物抑制HOS和143B细胞存活率,显著诱导HOS细胞凋亡(P0.01),Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK显著抑制忍冬藤提取物诱导的HOS细胞凋亡(P0.05、0.01);忍冬藤提取物显著提高HOS细胞Caspase-3活性(P0.01),显著改变HOS细胞线粒体膜电位(P0.05、0.01),显著上调HOS细胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9、Cyt-C和Bax/Bcl-2蛋白表达水平(P0.05、0.01),显著下调Bcl-2蛋白表达水平(P0.05、0.01)。结论忍冬藤提取物能够抑制骨肉瘤细胞增殖,并通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表达,激活Caspase级联反应有关。     

补肾壮督方对大鼠退变椎间盘细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:观察补肾壮督方对大鼠退变椎间盘细胞凋亡的影响,探讨其改善椎间盘退变的机制。方法:100只SD雄性大鼠,采用纤维环全层针刺造模,随机分为空白组,模型组,补肾壮督方低、中、高剂量组(0. 38,0. 77,1. 53 g·kg-1),连续中药灌胃4周后,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠椎间盘组织病理学变化;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测退变椎间盘中髓核细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测椎间盘组织中活化半胱氨酸蛋白酶-3(active Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),细胞色素C(cyt C)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠椎间盘组织病理学评分显著增加,髓核细胞凋亡率明显增加(P 0. 05),active Caspase-3,cyt C和Bax表达量均明显增加(P 0. 05),Bcl-2表达量明显下降(P 0. 05)。与模型组比较,补肾壮督方低、中、高剂量组组织病理学评分明显降低(P 0. 05),髓核细胞凋亡率明显减少(P 0. 05),active Caspase-3,cyt C及Bax表达量均明显下降(P 0. 05),Bcl-2表达量明显增加(P 0. 05)。结论:补肾壮督方可能通过减少active Caspase-3,cyt C和Bax蛋白表达,增加Bcl-2蛋白表达,抑制线粒体凋亡通路,并存在一定剂量依赖性,从而改善椎间盘退变。     

铁筷子挥发油对慢性脑缺血致血管性认知功能障碍大鼠的作用及机制研究

目的 探究苗药铁筷子[腊梅Chimonanthus praecox及山腊梅C. nitens的干燥根]挥发油对慢性脑缺血（chronic cerebral hypoperfusion,CCH）致血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment,VCI）大鼠的作用及机制。方法 采用改良的双侧颈总动脉结扎（bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）法建立CCH模型,将造模成功大鼠随机分为模型组及铁筷子挥发油高、中、低剂量（80、40、20 mg/kg）组和丁苯酞（63 mg/kg）组,另设假手术组,给予相应药物干预28 d,采用水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力;采用旷场实验、Y迷宫实验检测各组大鼠自主活动性和新奇事物探索能力;采用苏木素-伊红（HE）染色、Nissl染色、TUNEL染色观察各组大鼠大脑皮层及海马CA1区神经细胞结构变化、尼氏小体以及凋亡细胞数量变化;采用ELISA法检测各组大鼠血清中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）水平;采用比色法检测各组大鼠海马组织中乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）和乙酰胆碱转移酶（cholineacetyltransferase,ChAT）的活性;采用Western blotting法检测各组大鼠海马组织中BDNF、酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B,TrkB）、磷酸化TrkB（phosphorylated TrkB,p-TrkB）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3,Caspase-3）蛋白表达。结果 与模型组比较,铁筷子挥发油组大鼠逃避潜伏期缩短（P＜0.05、0.01）,穿越平台次数和跨格次数提高（P＜0.05、0.01）,在新异臂所待时间延长（P＜0.05）;神经细胞结构的变性得到改善,脑组织中尼氏小体的数量提高（P＜0.05）,细胞凋亡减少（P＜0.05）;血清中BDNF水平及海马组织中ChAT活性升高（P＜0.05、0.01）,海马组织中AChE活性降低（P＜0.05）;海马组织中BDNF、TrkB、p-TrkB、PI3K和p-Akt蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01）,Caspase-3蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论 苗药铁筷子挥发油可以改善CCH致VCI大鼠认知功能障碍,其作用机制可能与激活BDNF/TrkB/PI3K/Akt信号通路有关。     

三七总皂苷调控miRNA-466b抑制急性心梗大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的:观察三七总皂苷(panax notogin seng,PNS)对急性心肌梗死大鼠miRNA-466b及调控的细胞凋亡相关蛋白表达的影响,从转录后水平探讨PNS抗凋亡作用的分子机制。方法:36只雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组、模型组和PNS治疗组。结扎大鼠左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死模型,PNS治疗组于术前4 h,术后第1天和第2天分别肌肉注射PNS(1.429 mg·g-1),采用TUNEL,RT-PCR及Western blot等方法,观察各组大鼠心肌组织凋亡情况,检测miRNA-466b及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3),Caspase-9和Bcl2L13基因和蛋白表达。结果:与模型组比较,PNS治疗组可明显减少心梗面积和心肌细胞凋亡(P0.05);模型组大鼠心肌组织miRNA-466b表达与假手术组没有明显变化,而经PNS干预后miRNA-466b表达显著上升,与模型组比较有显著性差异(P0.01);与假手术组比较,急性心梗模型组大鼠心肌组织Caspase-3表达明显升高(P0.05),PNS则能明显下调模型组大鼠Caspase-3表达(P0.05,P0.01),同时急性心梗大鼠造模后Bcl2L13和Caspase-9的mRNA和蛋白变化不明显,而PNS干预后则能显著下调Bcl2L13和Caspase-9的表达(P0.05,P0.01)。结论:PNS对急性心梗大鼠心肌细胞凋亡有显著保护作用,其作用机制可能是通过上调miRNA-466b表达,下调Bcl2L13,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达来发挥拮抗凋亡、保护细胞的作用。     

加味济生肾气汤对STZ诱导的糖尿病肾病大鼠足细胞及其自噬的影响＊

目的 探究加味济生肾气汤对糖尿病肾病大鼠肾脏足细胞和自噬作用的影响，为糖尿病肾病的中药治疗奠定一定基础。方法 将66只SD大鼠按照随机数字表法分成对照组，模型组，羟苯磺酸钙组，加味济生肾气汤低、中、高剂量组。造模后，各组分别以生理盐水，羟苯磺酸钙，1 mL/kg/d、4 mL/kg/d、10 mL/kg/d药物浓度的加味济生肾气汤处理。6周后，取大鼠肾脏，电镜观察肾脏足细胞形态；免疫组化检测Nephrin的表达；Western blot检测LC3II/I和P62的表达。结果 模型组大鼠肾小球基底膜可见显著增厚，足细胞排列较紊乱，数目减少，足突融合，在加味济生肾气汤中剂量组和高剂量组中上述症状得以缓解；与对照组比较，模型组大鼠肾组织中的Nephrin水平均明显降低，LC3II/I比值显著下降，P62水平显著升高。与模型组比较，加味济生肾气汤高剂量组大鼠肾组织中的Nephrin水平均明显升高，LC3II/I比值均显著升高，P62水平显著降低（P < 0.05）。结论 加味济生肾气汤通过提高自噬水平，减少足突发生融合，提高肾脏的过滤功能。