心脏圆锥动脉干发育相关基因的筛选研究

目的检测剔除心脏神经嵴心脏组织与正常心脏组织之间表达差异基因,筛选心脏圆锥动脉干发育相关基因.方法用电刺激方法建立鸡胚实验模型;用抑制消减杂交法筛选出实验组和对照组心脏组织之间存在的差异表达基因;构建减数杂交文库,用cDNA基因芯片技术验证,并进行测序.结果31.8%克隆在实验组表达显著减少.经检验确定13种不同基因片段,有7种与已知鸡基因序列完全匹配,分别为心脏α actin、DEAD box RNA解旋酶、核糖体蛋白L7a、线粒体基因组、GAPDH、肽延长因子-1;有4种基因片段与人、鼠等种属已知基因存在83%~89%的同源性,分别为核糖体蛋白S3、L10a、SNX1、CIRBP等;有2种在公共数据库未查到同源序列.结论有多种基因参与心脏圆锥动脉干胚胎发育;抑制消减杂交和基因芯片技术是筛选差异表达基因的有效方法.     

心脏圆锥干畸形TBX1基因多态性研究

心脏圆锥干畸形(Conotruncal Heart Malformation,MIM217095)是一类较常见的先天性心脏病,占先天性心脏病的1/4～1/3,常见有法乐氏四联症,肺动脉瓣畸形,大动脉转位和右室双出口等.1988年,Pirepont等发现圆锥干畸形有较强的复发倾向,是一种遗传性疾病[1];1997年Chieffo等在22q11.2克隆了TBX1基因,并认为心脏圆锥干畸形发病与TBX1基因有关,但突变检测未发现有意义的突变[2].     

先天性心脏圆锥动脉干畸形患者Cx43基因突变的初步研究

目的 探讨先天性心脏圆锥动脉干畸形(CTD)患者细胞间隙连接蛋白43(Cx43)基因突变的发生情况。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)分析结合DNA测序，对37例CTD、26例非CTD先心病、10例正常小儿进行了Cx43编码序列检测。结果 正常对照SSCP均表现为相同的带型。37例CTD中，仅1例法洛四联症(TOF)合并房间隔缺损(ASD)的患者出现了不同于正常对照的SSCP带型，经测序证实发生了717G→A碱基替换，但由于不引起所编码氨基酸的改变，考虑为沉默多态位点。其他CTD患者及26例非CTD先心病患者均未检测到Cx43编码序列的突变。结论 Cx43基因突变在CTD等先心病患者中可能并不常见。717G→A可能是一种新的单核苷酸多态位点。     

心脏圆锥动脉干畸形患儿TBX1C基因3′UTR区域突变分析

目的 筛查心脏圆锥动脉干畸形（CTHD）患者中TBX1C基因3′UTR区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响TBX1C基因表达的可能机制。方法 选取无22q11-2区微缺失的52例CTHD患儿（CTHD组）和89名健康儿童（对照组）作为研究对象,PCR扩增TBX1C基因完整3′UTR区序列,所有扩增片段均进行双向测序;将测序结果与GenBank中TBX1C 3′UTR序列（NM 080647.1）进行比对,筛查出可能存在的基因突变;PicTar和TargetScan在线预测软件预测可能与TBX1C基因3′UTR区结合的微RNA （miRNA）,分析TBX1C基因3′UTR区突变对miRNA调控TBX1C基因表达的影响。结果 在CTHD组中发现1例突变c.＊164_＊165insC,即在距离终止密码子164位与165位核苷酸之间插入1个胞嘧啶;该突变在对照组中不存在,其他研究中未见报道,为新发突变;预测结果显示10种miRNA能与TBX1C基因3′UTR区结合,该突变并不位于10 种miRNA与TBX1C3′UTR的结合区域。结论 TBX1C基因3′UTR区域存在新发突变c.＊164_＊165insC,该突变可能改变TBX1C3′UTR区域与miRNA结合的空间构象,进而影响miRNA对TBX1C基因表达的调控作用。     

转录因子GATA-4突变在心脏圆锥动脉干畸形患儿中的研究

目的：研究心脏圆锥动脉干畸形患儿新的分子病因。方法：收集48例圆锥动脉干畸形患儿和100例健康对照者外周血标本,使用血液基因组DNA抽提试剂盒抽提外周静脉血基因组DNA。应用聚合酶链反应扩增GATA-4基因6个外显子编码区和邻近序列后分别直接测序,借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变。结果：在1例永存动脉干患儿GATA-4基因识别出1个错义突变,即第267位的密码子由GTG变为ATG,亦即c．799G〉A（P．V267M）。结论：转录因子GATA-4基因c．799G〉A（P．V267M）突变可能与圆锥动脉干畸形的发生有关。     

应用抑制性消减杂交技术筛选成骨肉瘤转移相关基因

目的：探讨与人成骨肉瘤转移相关的基因表达变化．方法：通过抑制性消减杂交技术从一对同一亲本、转移表型不同的人成骨肉瘤细胞株中分别提取细胞总RNA，筛选差异表达基因并测序，将结果与核酸数据库进行同源性比较．结果：获得12个在低转移成骨肉瘤中高表达的、均与已知的人类基因片段有很高同源性的核甘酸片段．结论：差异表达的基因可能与成骨肉瘤细胞转移生物学特性呈密切相关，特别是在维持肿瘤细胞自身稳定、防止转移中起重要作用．     

永存动脉干伴室间隔缺损1例报告

永存动脉干为一种罕见的先天性心脏畸形 ,此种畸形是由于把动脉圆锥分割成主动脉和肺动脉的圆锥嵴缺如引起的。本文报道 1例。1　病例介绍男性 ,死胎 ,孕 38+ 2 周 ,身长 4 3cm ,全身青紫 ,口唇及指甲紫绀 ,体表无畸形。心脏横径 4 .5cm ,见主动脉和肺动脉形成单一的动脉干 ,长约 2 .5cm ,基底有四个动脉瓣 ,冠状动脉开口于动脉瓣内。剪开心脏 ,见室间隔缺损约 2cm× 1.5cm ,为两房一室。此动脉干横跨于缺损处 ,未见左右动脉分支 ,而仅见由降主动脉发出的左右支气管动脉供应双侧肺脏血液。左心室壁厚 0 .7cm ,右心室壁厚 0 .6cm。镜检 :心肌…     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的 :从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中 ,初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法 :随机挑选 48个片段作反Northern印迹杂交分析 ,将杂交信号有差别的 15个片段送测序公司进行测序 ,用Gen BankBlast程序检索 ,以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因 ,观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果 :所获得的 7个序列中 :3y5 9与已知基因同源性很小 ,且 3y5 9在 30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中 ,19例 (6 3.3 % )表达有差别 ,11例 (36 .7% )表达无差别 (P <0 .0 5 )。 3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外 5个片段 3y2 0 ,3y14,3y90 ,3y91和 3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingprotein ,Keratin6 (KRT6C)和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论 :3y5 9可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现 ,geminin基因 ,核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingpro tein ,Keratin6 (KRT6C) ,内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关     

应用抑制性消减杂交筛选大鼠不同程度肝纤维化的上调基因

目的应用抑制消减杂交技术,筛选大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化和重度肝纤维化组织中差异表达的上调基因。方法利用抑制消减杂交技术,构建大鼠轻度肝纤维化和重度肝纤维化2个差异cDNA文库,并挑选36条上调显著的基因进行测序鉴定。结果获得1152个克隆,其中有1036个含有插入片段。挑选32个克隆测序,与GenBank数据库进行初步比较,其中28条与已知基因的部分序列高度同源。结论应用抑制消减杂交技术成功构建了轻度肝纤维化和重度肝纤维化差异表达基因的cDNA削减文库,为进一步研究肝纤维化发生、发展和逆转的机制奠定了理论基础。     

应用抑制性消减杂交筛选大鼠不同程度肝纤维化的上调基因

目的 应用抑制消减杂交技术,筛选大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化和重度肝纤维化组织中差异表达的上调基因.方法 利用抑制消减杂交技术,构建大鼠轻度肝纤维化和重度肝纤维化2个差异cDNA文库,并挑选36条上调显著的基因进行测序鉴定.结果 获得1 152个克隆,其中有1 036个含有插入片段.挑选32个克隆测序,与GenBank数据库进行初步比较,其中28条与已知基因的部分序列高度同源.结论 用抑制消减杂交技术成功构建了轻度肝纤维化和重度肝纤维化差异表达基因的cDNA削减文库,为进一步研究肝纤维化发生、发展和逆转的机制奠定了理论基础.     

急性髓系白血病细胞多药耐药相关基因的筛选

目的筛选急性髓系白血病细胞多药耐药相关基因。方法在建立HL-60／DNR多药耐药（MDR）细胞系的基础上，采用抑制消减杂交的方法结合基因芯片技术建立HL-60／DNR抑制消减杂交文库，并挑选其中部分克隆进行序列测定和同源性分析。结果HL-60／DNR对多种化疗药物均产生了不同程度的耐受。在所构建的HL-60／DNR抑制消减杂交文库中，经过基因芯片筛选出明显差异表达克隆共有14个；进一步分析发现这些基因在白血病细胞多药耐药中的作用大多未见报道。结论多种基因（已知的或未知的）均参与了急性髓系白血病细胞多药耐药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究急性髓系白血病细胞多药耐药产生的机制奠定了必要的理论基础.     

高甘油三酯血症大鼠高血凝相关基因的筛选

目的：筛选实验性高甘油三酯血症诱发大鼠高血凝的相关基因。方法：采用抑制性消减杂交技术构建大鼠高血凝cDNA消减文库，并用半定量RT-PCR初步鉴定差异表达基因。结果：成功构建了大鼠高血凝cDNA消减文库，20个阳性克隆的序列测定和同源比较表明这些克隆代表了19个基因，其中8个为已知基因但首次发现与高血凝相关，11个为新的ESTs，已被GenBank收录。半定量RT-PCR证明3个ESTs(HC002、HC057和HC067)为表达上调基因。结论：所构建的消减文库消减效率高，为进一步筛选、克隆大鼠高血凝相关的新基因奠定了基础，HC002、HC057和HC067可能与高甘油三酯血症诱发的高血凝相关。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,最终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.     

高脂血症敏感兔肝组织差减cDNA文库的构建

目的：构建高脂血症敏感兔肝组织表达基因的抑制差减cDNA文库。方法：分别从兔高脂血症敏感组和非敏感组肝组织分离mRNA，合成双链cDNA，酶切后将敏感组cDNA分成两组，分别与不同的接头连接，再通过再轮差杂交和两次抑制PCR得到两者之间差异表达的cDNA，将PCR产物与T／A载体连接构建差减cDNA文库，挑取克隆进行PCR扩增鉴定，结果：建的差减cDNA文库包含500个克隆，其中463个有插入片段，大小范围在250－700bp之间。结论：用抑制性差减杂交及T／A克隆技术成功构建了高脂血症敏感免疫差异表达基因差减cDNA文库。     

人膀胱癌异质性表型相关基因的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定膀胱肿瘤异质性生物学表型相关的基因。方法 以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系为材料,采用抑制性削减杂交技术筛选差异表达的基因片段,构建cDNA文库;挑取克隆进行筛选,获得差异表达片段,测序并与Genbank比对,Northernblotting验证差异片段在两株细胞系的不同表达。结果 建立了两个消减文库,分别含有168和206个白色克隆,白色克隆含有约200～700bp的插入片段,对这些克隆进行筛选,获得35个差异表达基因片段,其中15个对应于细胞骨架蛋白、细胞代谢酶基因等已知基因,另外19个为未知功能基因,1个为新EST片段,注册Genbank（注册号为DR008207）。结论 抑制性消减杂交技术是筛选、克隆差异表达基因的有效手段;keratin7、Vimentin等细胞骨架蛋白的不同表达,与细胞形态的表型差异有关;DDH等代谢基因的不同。与细胞的药物敏感性差异相关;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

新生大鼠大脑特异表达基因的初步筛选

目的 获得新生大鼠大脑特异表达的cDNA序列,筛选与新生大鼠大脑发育相关的未知的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）。方法 以新生大鼠的大脑mＲＮＡ逆转录cDNA作为实验组（tester）,成年大鼠大脑mRNA逆转录cDNA作为对照组（driver）,经抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH)方法消除同成年大鼠大脑相同的cDNA,并富集低丰度基因,克隆建立新生大鼠大脑特异表达的cDNA文库。结果 获得11个cDNA基因片段,同时将测序结果与Genebank进行同源性比较,发现5个首次在大鼠大脑中检测到的基因序列。结论 SSH是目前寻找差异表达基因的最为简便有效的方法,为寻找大鼠大脑发育差异表达基因提供了一些线索。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义