应用基因芯片技术对乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节基因的研究

目的应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBVDNAP)三个功能域[(N末端蛋白(TP),逆转录酶DNA多聚酶(PR),核糖核酸酶H(RNaseH)]的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明HBVDNAP对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法以常规分子生物学技术分别构建真核表达载体pcDNA3.1()TP,pcDNA3.1()PR和pcDNA3.1()RNaseH,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果TP有111条基因表达水平上调,88条基因表达水平下调。PR有79条基因表达水平上调,90条基因表达水平下调。RNaseH有113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调。结论应用基因芯片成功筛选HBVDNAP三个功能域蛋白转染细胞后的差异表达基因,为进一步研究HBVDNAP的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成XTP6基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP6基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现21个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据.     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究

目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP) 的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎陧性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制. 方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP 编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA 芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111 个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.     

应用基因表达谱芯片技术筛选HCV p7蛋白反式调节基因

目的应用基因芯片技术对pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-p7分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被HCV p7蛋白反式调节的靶基因,研究p7蛋白的生物学功能。方法以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增p7蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并逆转录成cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,有1个基因表达水平显著上调,22个基因表达水平显著下调。结论 HCV p7蛋白是一种反式调节因子,p7基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响.方法设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物,以含有HBV全基因组的质粒G376 A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3.1(-)-HBsAg.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,29个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据.     

基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因

目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能. 方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.     

基因表达谱芯片技术筛选XTP1基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-XTP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为eDNA,与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和。DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有3个基因表达水平显著上调,24个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选

目的应用表达谱基因芯片技术，研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子DNA结合蛋白1(SBP1)反式调节基因，阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成SBP1基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增SBP1基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误。提取高质量的mRNA，逆转录为cDNA，进行cDNA芯片分析。在1152个基因容量的表达谱芯片的筛选中，发现有12个基因表达水平显著上调，6个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术（bioinformatics)，克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5AWll，新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt)，编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

Study of transactivating effect of pre-S2 protein of hepatitis B virus and cloning of genes transactivated by pre-S2 protein with suppression subtractive hybridization

AIM: To investigate the transactivating effect of pre-S2 protein of hepatitis B virus (HBV) and construct a subtractive cDNA library of genes transactivated by pre-S2 protein with suppression subtractive hybridization (SSH) technique, and to pave the way for elucidating the pathogenesis of HBV infection. METHODS: pcDNA3.1(-)-pre-S2 containing pre-S2 region of HBV genome was constructed by routine molecular methods. HepG2 cells were cotransfected with pcDNA3.1 (-)-pre-S2/pSV-lacZ and empty pcDNA3.1(-)/pSV-lacZ. After 48 h, cells were collected and detected for the expression of β-galactosidase (β-gal). SSH and bioinformatics techniques were used, the mRNA of HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-pre-S2 and pcDNA3.1(-) empty vector was isolated, respectively, cDNA was synthesized. After digestion with restriction enzyme RsaI, cDNA fragments were obtained. Tester cDNA was then divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR, amplified cDNA fragments were subcloned into pGEM-Teasy vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E.coli strain DH5oα. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after PCR. RESULTS: The pre-S2 mRNA could be detected in HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-pre-S2 plasmid. The activity of β-gal in HepG2 cells transfected with pcDNA3.1 (-)-pre-S2/pSV-lacZ was 7.0 times higher than that of control plasmid (P<0.01). The subtractive library of genes transactivated by HBV pre-S2 protein was constructed successfully. The amplified library contains 96 positive clones. Colony PCR showed that 86 clones contained 200-1 000 bp inserts. Sequence analysis was performed in 50 clones randomly, and the full length sequences were obtained with bioinformatics method and searched for homologous DNA sequence from GenBank, altogether 25 coding sequences were obtained, these cDNA sequences might be the target genes transactivated by pre-S2 protein. CONCLUSION: The pre-S2 protein of HBV has transactivating effect on SV40 early promoter. The obtained sequences may be target genes transactivated by pre-S2 protein among which some genes coding proteins involved in cell cycle regulation, metabolism, immunity, signal transduction and cell apoptosis.This finding brings some new clues for studying the biological functions of pre-S2 protein and further understanding of HBV hepatocarcinogesis.