重组质粒导入真核细胞的两种方法比较

目的：比较糖化多聚赖氨酸介导和电穿孔两种方法将重组质粒导入真核细胞的优缺点。方法：用最佳电压、电容、温度、DNA浓度进行电穿孔转染,或者先使重组质粒与糖化多聚赖氨酸电性结合后,再与2.2.15细胞共同温育的方法,分别将pcEP4-aC重组质粒导入2.2.15细胞,经潮霉素筛选,比较两种方法的优劣。结果：两种方法都能成功地将重组质粒导入2.2.15细胞,但糖化多聚赖氨酸介导者,细胞生存时间较长。结论：糖化多聚赖氨酸导向配体具有良好的导入重组质粒进入肝细胞的功能,且更适合于应用。     

Ⅱ型肺泡上皮细胞转染Napsin A基因对肺纤维化的干预作用

目的 探讨Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞对肺纤维化的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞染色体中并鉴定.予转化生长因子β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外肺纤维化模型,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化;用MTT法检测A549细胞转基因前后受TGF-β1刺激情况下增殖能力的变化,并绘制生长曲线;分别用RT-PCR和Western印迹方法检测未转基因和转基因A549细胞被TGF-β1干预后其表达E钙蛋白和纤维连接蛋白基因和蛋白水平的变化,以判断其发生上皮-间质转化(EMT)的情况;用Western印迹方法检测A549细胞转基因前后表达黏着斑激酶(FAK)蛋白量的变化,探讨Napsin A干预肺纤维化的机制.结果 重组质粒PLJM1-Napsin A测序结果与设计序列完全符合,转Napsin A基因A549细胞表达Napsin A基因和蛋白均显著高于非转基因细胞组(P＜0.01).细胞经TGF-β1刺激后形态上演变为间质细胞,提示体外构建肺纤维化模型成功.MTT法检测转基因细胞在TGF-β1诱导下其增殖速度减慢(P＜0.05);E钙蛋白的基因和蛋白表达水平在体外肺纤维化模型中明显下调(E钙蛋白mRNA:A549-PLJM1:0.77±0.09,A549-PLJM1-Napsin A:0.79±0.03,A549+TGF-β1:0.41±0.05,A549-PLJM1+TGF-β1:0.40±0.05;E钙蛋白分别为:0. 76±0.06,0.73±0.09,0.20±0.05,0. 22±0.03,P＜0.01),相反纤维连接蛋白则明显上调(P＜0.01),但转染Napsin A基因后其变化幅度减小(P＜0.01,P＜0.05).体外肺纤维化模型中,细胞FAK蛋白表达量增多(A549:0.49±0.04,A549-PLJM1:0.50±0.06;A549-PLJM1-NapsinA:0.48±0.08;A549+TGF-β1:3.49±0.61;A549-PLJMI+TGF-β1:3.54±0.25,P＜0.01),但转基因细胞上调趋势显著小于未转基因细胞组(P＜0.01).结论 转染Napsin A基因至Ⅱ型肺泡上皮细胞可以抑制肺纤维化,其作用机制可能与抑制整合素信号传导通路有关.     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞，测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况，进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase，pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低，通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接，腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

人alpha防御素1真核表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响.方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断.构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设pSecTag转染组、脂质体转染组和未转染组作为对照.RT-PCR验证HNP1的表达,MTT法检测肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pSecTag-HNP1,测序正确.转染A549细胞后,RT-PCR成功扩增出HNP1片断.与其他3组相比,HNP1转染A549细胞48 h后细胞的生存率降低,差异有统计学意义(P均<0.05).流式细胞仪及PI染色结果显示pSecTag-HNP1转染后的细胞凋亡增多(P<0.05).结论:转染pSecTag-HNP1后,重组HNP1能够在A549细胞中表达并有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

VEGF-C-siRNA对人肺癌细胞A549生物学行为的影响

目的 初步探讨靶向VEGF-C基因的siRNA转染肺癌细胞A549后对其生物学行为的影响.方法 构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒并转染A549细胞,免疫印迹法检测蛋白的表达水平,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性.结果 成功构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒.VEGF-C-siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱,生长抑制率明显高于阴性对照组(P＜0.01),且表现出时间依赖性.结论 靶向VEGF-C的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制肿瘤细胞增殖.     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒重组体构建

目的 构建大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒介导的表达载体。方法 提取大鼠脑组织总RNA．用逆转录PCR扩增DNA多聚酶β（POLB）的编码区，与T载体连接，作DNA测序后，酶切POLB基因并连入腺病毒穿梭质粒pAdTraek-CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。酶切鉴定，重组腺病毒质粒（pAd-polb）Lipofectamine2000转染293细胞，用293细胞扩增重组腺病毒。结果 8个TA克隆中有2个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLB cDNA序列完全一致。DNA序列正确的POLB重组腺病毒质粒Ad-polb转染293细胞后，荧光显微镜下可见绿色荧光。结论 用TA克隆和AdEasy系统，成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体。     

小鼠Collectrin正反义真核表达载体的构建及其功能

目的:构建新基因Collectrin的正反义真核表达载体,研究其与细胞生长的关系.方法:以PCR的方法扩增Collectrin的开放阅读框序列,与载体pcDNA3.1/V5-His相连构成融合基因表达质粒.将重组后的质粒进行细菌转化,质粒扩增、纯化后,测序鉴定Collectrin的正义及反义序列.以脂质体介导的方法体外转染肾皮质集合管细胞系(M-1).以β-Gal staining的方法测定转染效率.分别行逆转录-PCR和Western blot,检测不同融合基因转染后细胞Collectrin mRNA和蛋白水平的表达变化.以四甲基偶氮唑蓝(MTF)参入法分别在第24小时、第48小时测定不同融合基因转染后细胞增殖活性.结果:M-1细胞在融合基因转染第24小时转染效率最高.Collectrin正义转染组较反义、空载体和正常对照组在核酸和蛋白水平表达量都显著增高,Collectrin反义转染组蛋白表达较其他组明显下调.反义转染组细胞较其他组明显减少.结论:成功构建了Collectrin正义及反义真核表达载体,Collectrin是维持细胞生长存活的重要元件.     

聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物阳离子纳米粒介导宫颈癌细胞基因转染效率的研究

目的 优化聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物(PEI-PLGA)阳离子纳米粒介导的癌细胞基因转染效率.方法 用二步法制备报告基因质粒pCMVβ/PEI-PLA纳米粒复合物,透射电镜观察粒子形态,Zeta粒度仪测定粒径和表面电荷.以pCMVβ基因质粒与纳米粒的比(N/P)、转染时间和基因转染剂量为条件,转染效率为指标,正交设计法优化pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物的转染效率.结果 pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物呈单分散球形,N/P比为10:1,Zeta电位为+16.5 mV,平均粒径为217 nm,基因质粒剂量为每孔3 μg时,纳米粒复合物的转染效率最高为16.35%.结论 PEI-PLGA纳米粒可有效将报告基因质粒转移入宫颈癌细胞,优化实验条件可提高转染效率.     

腺病毒介导MnSOD转染对肺癌细胞生长及体内抗肿瘤作用的影响

目的研究腺病毒介导锰超氧化物歧化酶(Ad-MnSOD)对肺腺癌细胞生长影响及在体内抗肿瘤作用.方法应用细胞基因转染、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),观察Ad-Mn-SOD转染A549细胞后对肺癌A549细胞生长的影响,并将A549细胞接种到裸鼠皮下后,注射Ad-MnSOD及Ad-LacZ到瘤体内,观察对肿瘤生长的影响.结果50MOI Ad-Laze转染率达90%以上,Ad-MnSOD转染A549细胞后MnSOD mRNA表达增加,MTT法检测显示转染Ad-MnSOD A549细胞组生长率(78.7%)低于转染Ad-LacZ的对照组(92.2%);A549细胞接种裸鼠后,用Ad-MnSOD及Ad-LacZ分别注射于瘤体内,Ad-MnSOD组瘤体生长速度低于Ad-LacZ对照组.结论Ad-MnSOD转染A549细胞后MnSOD可明显抑制A549细胞生长及肿瘤在裸鼠体内的生长,MnSOD对肺癌细胞A549有明显抗肿瘤作用.     

多聚赖氨酸对胎鼠颌下腺细胞培养的影响

目的：研究以多聚赖氨酸为生长底物对体外培养胎鼠颌下腺上皮细胞生长的影响。方法：以多聚赖氨酸包被培养板，对胎鼠颌下腺上皮细胞进行分离培养，应用相差显微镜及电镜观察细胞生长特性，免疫组织化学方法对细胞来源进行鉴定。结果：颌下腺细胞在包被有多聚赖氨酸的培养皿表面生长分化良好，呈单层生长；免疫组织化学检测单克隆角蛋白、上皮膜抗体呈阳性表达。结论：多聚赖氨酸在体外培养的过程中，可以促进细胞的黏附与生长。     

体外培养的兔骨髓基质细胞在牛松质骨载体上的生长与分化

目的体外培养兔骨髓基质细胞（Marrow Stromal Cells,MSCs）,研究其生物学特性,为骨组织工程应用提供基础。方法抽取新西兰白兔骨髓,进行体外培养并传代,观察细胞生长情况,然后将细胞与牛松质骨（bovine cance Uousbone,BCB）载体复合。通过用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞粘附和生长情况,同时测定碱性磷酸酶活性和细胞增殖分化情况。结果骨髓基质细胞在体外培养生长良好,细胞与支架复合后可以在支架表面粘附伸展。结论骨髓基质细胞在体外生长良好,可以作为种子细胞在组织工程中应用。     

多聚左旋赖氨酸促进大鼠肢芽细胞软骨分化的研究

目的:探讨多聚左旋赖氨酸(PL)对大鼠肢芽细胞向软骨细胞分化的促进作用及其可能机制。方法:取大鼠肢芽细胞在含不同剂量PL的培养液中培养4 d,根据培养细胞所形成的软骨集落形成情况、与阿尔新蓝结合量和Ⅱ型胶原的表达情况,判断PL促进肢芽细胞向软骨细胞分化现象;根据不同时间添加PL来推断其发挥最大作用的时间;用免疫组化检测神经钙粘附蛋白的表达。结果:PL促进培养中大鼠肢芽细胞软骨集落的形成的最佳剂量可能为10μg/mL;PL发挥最大作用的时间为培养的第24 h内;免疫组化显示:5μg/mL组中Ⅱ型胶原和神经钙粘附蛋白的表达增强。结论:PL在一定浓度范围内以剂量依赖性方式促进大鼠肢芽细胞向软骨细胞分化且可能是通过增强神经钙粘附蛋白的表达来完成的。     

一种简便的ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法

］目的：建立一种简便、灵敏的ε 聚赖氨酸(ε PL)产生菌的筛选方法。方法：利用产正电分泌物的菌株和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产正电分泌物的菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应,从菌株中筛选,得到3株生物碱产生菌。结果：对产生物碱的菌株发酵液进行ε PL含量分析,确定1株ε PL高产菌Z 18。结论：经鉴定Z 18 为白色链霉菌。     

超顺磁性氧化铁(SPIO)与多聚赖氨酸(PLL)纳米粒的制备、结构验证及其空间结构表征

 目的  探讨葡聚糖修饰的超顺磁性氧化铁(super-paramagnetic iron oxide,SPIO)与多聚赖氨酸(polylysine,PLL)纳米粒的制备及其结构验证和空间结构表征。方法  在共沉淀法制备葡聚糖修饰的SPIO基础上,加入PLL制备出一种新的SPIO-PLL纳米粒,利用粒度电位分析仪、透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)对SPIO-PLL的粒径、电位、形貌学进行检测;高效液相凝胶色谱法(gel permeation chromatography,GPC)、红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)及核磁共振氢谱法(1HNMR)对SPIO PLL连接成功与否进行验证;高精度的原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)对SPIO-PLL的结构、形态及连接状态进行空间结构表征。结果  粒度电位分析和TEM结果显示SPIO-PLL的平均粒径为7.37 nm,平均电位为13.6 mV;GPC、FTIR及1HNMR结果显示SPIO及PLL之间已经成功连接;高精度AFM清楚显示出SPIO与PLL之间以亚胺键形式稳定相连。 结论  成功制备出一种性质稳定、粒径较小的新型SPIO-PLL纳米粒,这将对随后的肿瘤特异性探针制备奠定一定的基础。     

两种方法研究新型光敏剂五聚赖氨酸-2-羰基酞菁锌与牛血清白蛋白相互作用

目的研究新型光敏剂五聚赖氨酸-2-羰基酞菁锌（ZnPc-（Lys）5）与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用。方法从BSA角度采用荧光光谱法和紫外可见光谱法通过荧光猝灭实验探讨ZnPc-（Lys）5与BSA相互作用的猝灭机制、结合常数及结合位点;从ZnPc-（Lys）5角度采用胶束荧光增敏法测定ZnPc-（Lys）5浓度通过Scatchard方程计算ZnPc-（Lys）5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数。结果荧光猝灭实验结果表明ZnPc-（Lys）5对BSA的荧光有强烈的猝灭作用,猝灭机制主要是静态猝灭形成基态配合物。不同温度（298,303,308,313,318 K）的结合常数K1分别为12.1×104L/mol,7.69×104L/mol,6.12×104L/mol,4.57×104L/mol,3.76×104L/mol,结合位点数分别为0.93,1.02,1.07,1.13,1.17。Scatchard方程计算出298 K结合常数K2为1.557×105L/mol,结合位点数位1.07。结论从两个方面计算的结合常数和结合位点数基本一致,ZnPc-（Lys）5与血清白蛋白之间主要通过形成基态配合物的方式相互作用,进入血清白蛋白中1个结合位点。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

醋柳黄酮缓释片的药动学初步研究

目的:研究醋柳黄酮缓释片在家犬体内的药动学过程,测定其药动学参数,计算缓释片相对于普通片的生物利用度。方法:将实验动物分为两组,分别用醋柳黄酮缓释片和普通片进行口服给药,用高效液相色谱法测定血浆药物浓度,应用3P97软件求算药动学参数。结果:醋柳黄酮缓释片及普通片的tm ax分别为4.87 h和2.87 h,Cm ax分别为每小时0.46μg.L-1和每小时0.56μg.L-1,缓释片的相对生物利用度为111.7%。结论:醋柳黄酮缓释片与普通片均符合一室模型,缓释片与普通片具有生物等效性,且醋柳黄酮缓释片有明显的缓释效果。     

主动脉窦瘤破裂的外科治疗

报告２０例主动脉窦瘤破裂修复术的结果。１７例男性，３例女性。年龄７～５６岁。痊愈１９例，另一例因急性肾功能衰竭一周后死亡。作者就发病机理，诊断和合并畸形的处理进行了讨论。