靶向hTERT的特异性siRNA抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖机制研究

目的筛选有效抑制肝癌细胞hTERT表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并检测其对hTERT蛋白表达、细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对hTERT的6条siRNA双链及一条阴性对照siRNA,以LipofectaminTM2000转染至肝癌SMMC-7721细胞。用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B法,SRB法)测定干扰后细胞增殖的变化,RT-PCR测定hTERTmRNA的表达,筛选出有效序列。有效序列转染后,进一步采用Western blot法检测hTERT蛋白水平的变化,AnnexinV-FITC/PI双染、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果以SRB和RT-PCR法筛选出的两条有效siRNA:siRNA-2和siRNA-6,能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,对细胞的抑制率分别为45.3%、38.2%,能高度沉默hTERT mRNA的基因,沉默率分别为80%、75%。二者还能明显下调hTERT蛋白表达(P<0.05),明显增加凋亡,凋亡率分别为20.23%、17.94%。结论 siRNA-2和siRNA-6能特异性沉默肝癌SMMC-7721细胞hTERT基因表达,抑制增殖,降低hTERT蛋白水平,诱导凋亡,为肝癌基因治疗提供了有力的实验依据。     

siRNA干扰MT1H基因对肝癌HEPG2/ADM细胞耐药性的影响

目的探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H，MT1H）基因逆转HEPG2／ADM细胞耐药的可行性。方法将针对MT1H的siRNA导入肝癌耐阿霉素细胞株HEPG2／ADM中；用RT—PCR方法分析MT1H基因表达情况；Western blot检测MT1H蛋白的表达，MTT法观察细胞阿霉素耐药性；TUNEL检测阿霉素诱导细胞凋亡率。结果HEPG2／ADM细胞转染MT1H siRNA48h后，与对照组比较，MT1H siRNA转染组MT1H成部分mRNA和蛋白表达均表达明显下调，细胞对ADM的药物敏感性明显提高，ADM诱导凋亡率明显增加。结论MT1H siRNA能降低MT1H的表达，增强阿霉素对HEPG2／ADM细胞凋亡诱导作用，有效逆转HEPG2／ADM细胞耐药。     

HLA-E siRNA沉默肝癌细胞HLA-E基因的表达

目的针对HLA-EmRNA靶序列不同位点,设计合成多个siRNA链,定量分析其对HLA-E(+)肝癌BEL-7402细胞的基因沉默效率,筛选最佳抑制效果的siRNA。方法用IFN-γ(5×105IU·L-1)诱导BEL-7402细胞表达HLA-E基因,经流式细胞技术纯化后作为靶细胞。设计并合成3条HLA-E siRNA链(A、B、C),将各siRNA(0.1mmol·L-1)经脂质体Lipofectamin 2000转染至靶细胞。采用细胞免疫荧光、流式细胞技术、Western杂交、实时PCR等定量方法,比较48h后各siRNA的基因沉默效果,并观察HLA-E基因沉默对NK肿瘤细胞杀伤的影响。结果与空白对照、非特异组相比,3组(A、B、C组)HLA-E siRNA均明显抑制细胞HLA-E抗原、蛋白产物、mRNA、细胞表面HLA-E分子的表达(P<0.01),B、C组抑制效果接近90%,高于A组(P<0.01)。A、B、C组NK肿瘤杀伤率升高(P<0.01),而B、C组肿瘤杀伤效果高于A组(P<0.01)。结论经筛选的HLA-EsiRNA能特异、高效沉默肝癌细胞HLA-E基因表达,可能抑制其非经典HLA-Ⅰ途径免疫逃避,为肝癌"基因-免疫"治疗提供新的治疗策略。     

双靶点survivin siRNA治疗大肠癌的实验研究

目的:探讨双靶点survivin siRNA对大肠癌细胞SW620表达的影响及siRNA干扰后诱导肿瘤survivin表达降低的机制。方法:构建survivin双靶点特异性的RNA封闭性载体,survivin1,survivin2和survivin1 2通过培养大肠癌细胞SW620,survivin封闭性载体转染SW620细胞;Western-bloting检测survivin蛋白表达情况。结果:DNA测序证实表达质粒构建成功;对照组、survivin1,survivin2、survivin1 2组的β-actin蛋白均有显示,而且量基本相同;而survivin1,survivin2,survivin1 2蛋白表达明显低于对照组,survivin蛋白表达比对照组明显降低。结论:双靶点survivin siRNA能够下调大肠癌survivin表达,为大肠癌的治疗提供有价值的参考依据。     

短发夹RNA对前列腺癌细胞中PIM-1基因沉默效应的研究

目的:探讨脂质体介导的短发夹RNA(shRNA)对前列腺癌细胞中PIM-1基因表达的影响.方法:构建3种针对PIM-1 mRNA不同靶点的shRNA重组质粒表达载体,并转染前列腺癌PC-3细胞.分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中PIM-1 mRNA及蛋白的表达情况.结果:转染48 h后,3种PIM-1基因靶向性shRNA表达质粒均可抑制PC-3细胞中PIM-1 mRNA和蛋白的表达,其中靶向PIM-1 mRNA第707-725位和1080-1098位序列的重组质粒干扰效果更显著.结论:本研究所构建的PIM-1 shRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制前列腺癌细胞中PIM-1的表达,为下一步研究奠定了基础.     

PIM-1基因沉默对前列腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的:探讨RNA干扰(RNAi)沉默PIM-1基因表达对前列腺癌细胞体外生长的影响.方法:将RNAi重组质粒(pPIM1-shRNA-3)经脂质体介导转染前列腺癌PC-3细胞,用G418筛选稳定转染、PIM-1基因沉默的PC-3细胞.用空质粒载体(pRNAT-U6.1/Neo)稳定转染的PC-3细胞和正常培养的PC-3细胞作为对照,进行体外研究.利用细胞计数法分别检测3组PC-3细胞的增殖能力.利用流式细胞技术分别检测3组PC-3细胞的细胞周期及凋亡情况.结果:与两对照组PC-3细胞相比,PIM-1基因沉默组的PC-3细胞在培养48、72和96 h的细胞计数显著减少(P＜0.01),细胞周期中G1期细胞的比例显著升高,而S期细胞的比例显著降低(P＜0.01),发生早期凋亡的细胞比例明显升高(P＜0.01).结论:PIM-1基因沉默可以使得PC-3细胞的细胞周期进程受阻,抑制细胞增殖,并诱发细胞凋亡.PIM-1可以作为前列腺癌基因治疗的有效靶点,具有潜在的临床应用价值.     

siRNA沉默肝癌细胞报告基因瞬时表达效应的定量分析

目的研究小分子干扰RNA(siRNA)特异性抑制肝癌细胞基因瞬时表达的可行性和基因沉默效率。方法凝胶电泳成像观察siRNA体外孵育后的降解性,利用Cy3示踪观察其转染HepG2细胞后动力学变化。将报告基因(GFP)和siRNA共同瞬时转染至HepG2细胞,流式细胞仪、Western blot RT-PCR等分析特异性siRNA抑制报告基因瞬时表达的效应。结果siRNA在空白培养液中和转染细胞内可较长时间保持相对稳定。与空白和非特异siRNA相比,GFPsiR-NA明显抑制GFP蛋白产物和mRNA的表达(P<0·05)。结论特异性siRNA能高效沉默人肝癌细胞转染基因的瞬时表达,为基因治疗提供了一种新的治疗策略。     

siRNA沉默p62基因对人肝癌细胞Hep3B的生物学影响

目的:探讨siRNA沉默人肝癌细胞Hep3B中p62基因对人肝癌细胞的生物学影响.方法:人肝癌细胞Hep3B为靶细胞,siRNA通过Lipofectamine 2000转染Hep3B.首先从3条siRNA序列中筛选出1条沉默p62的最佳序列,然后将细胞分为空白对照组、siRNA组、Ncontrol(NC)组及脂质体(Lip)组.分别用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中p62、XPD、p53以及cyclinD1的mRNA和蛋白质的表达量,并用MTY法检测各组细胞的增殖能力.结果:siRNA组中p62、XPD、p53的mRNA表达较其他3组显著下调(P<0.01),而siRNA组中cyclinD1的mRNA表达较其他3组明显七调(P<0.01).Western blot检测结果显示各组细胞中p62、XPD、p53及cyclinD1的蛋白表达变化趋势与其mRNA变化趋势相一致.MTT检测显示siRNA沉默p62后,细胞增殖能力增强.结论:p62基因可能通过影响XPD、p53及cyclinD1从而抑制癌细胞生长,并且可能通过DNA损伤检控点来调控细胞增殖.     

POLD1基因反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用北大核心CSCD

目的研究DNA聚合酶δ催化亚基基因1(POLD1)反义RNA对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及相应机制。方法将SMMC-7721细胞分为3组:实验组、阴性对照组、空白组。实验组及阴性对照组分别将POLD1基因反义RNA表达质粒及空质粒分别转染至SMMC-7721细胞,未经处理的SMMC-7721细胞为空白组。用聚合酶链反应法检测各组细胞POLD1基因表达情况;用细胞计数-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;用流式细胞术分析细胞凋亡率;用蛋白质印迹(Western blot)法检测p53、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等凋亡相关蛋白表达量。结果实验组、阴性对照组和空白组肝癌细胞POLD1基因相对表达量分别为0.18±0.03,1.03±0.18和1.00±0.00;转染72 h增殖情况(OD_(450)值)分别为0.57±0.06,0.73±0.09和0.77±0.12;凋亡率分别为(23.43±4.12)%,(9.12±1.03)%,(1.24±0.14)%,实验组的上述指标与阴性对照组和空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论POLD1基因反义RNA可显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,且能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡。     

辛伐他汀对肝癌SMMC-7721增殖作用的初步研究

他汀类药物是临床上治疗高胆固醇血症的主要药物.研究发现他汀类药物具有抗肿瘤作用.实验室研究显示他汀类药物可抑制多种肿瘤得增殖,如乳腺癌[1]、结肠癌[2]、胰腺癌[3]、白血病[4]、恶性胶质瘤[5]等.有关他汀类药物对肝癌作用的实验室研究,笔者尚未见国内报道.本实验就他汀类药物对肝癌细胞增殖作用影响做一初步研究.     

人肝癌耐药细胞系的建立及生物学特性的研究

目的:培养建立耐药肝癌细胞模型QGY7703/DDP,分析人肝癌耐药细胞系生物学特性的改变.方法:应用人肝癌细胞株QGY7703,采用顺铂(DDP)逐步提高加间歇诱导历时6个月在体外建立QGY7703/DDP细胞系模型.观察该细胞的生长规律,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析暴露前后细胞的增殖和药物对细胞毒性的差异.结果:经过将QGY7703持续暴露,细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、DDP、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)的敏感性发生了改变.QGY7703/DDP对5-FU的耐药性是亲代细胞的1.533倍,对DDP的耐药性是亲代细胞的2.181倍,对ADM的耐药性是亲代细胞的7.080倍,对MMC的耐药性是亲代细胞的9.461倍.结论:化疗药物能够诱导培养的肿瘤细胞产生耐药性.     

守宫硫酸多糖对肝癌SMMC-7721细胞分化和增殖的影响

目的:研究守宫硫酸多糖(Gepsin)对肝癌SMMC-7721细胞分化和增殖的影响,并进一步探讨其可能的机制。方法:将不同浓度的Gepsin加入对数生长的SMMC-7721细胞进行培养,在不同的时间利用台盼兰染色观察细胞的增殖情况。同时,收集细胞培养上清液,利用联合放免法,以溴钾酚绿法分别观察Gepsin对甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)分泌的影响;利用酶联免疫吸附试验法观察Gepsin对转化生长因子(TGF)-β1、血管内皮生长因子(VEGF)分泌的影响;利用光镜观察Gepsin对SMMC-7721细胞形态的影响。结果:随着处理组Gepsin的浓度升高,SMMC-7721细胞的增殖明显受到抑制;而对细胞活率无明显影响。Gepsin可增加培养上清中的ALB分泌量,降低AFP分泌量。光学显微镜下可见加入Gepsin后细胞的形态由圆形变为纺锤形。Gepsin对培养上清分泌的VEGF无影响,但可使TGF-β1增加。结论:Gepsin可明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,诱导SMMC-7721细胞分化。其机制可能是通过上调TGF-β1来诱导肝癌细胞分化实现的。     

沉默Rock2对肝癌细胞增殖及凋亡作用的研究

目的:探讨沉默Rock2基因对人肝癌细胞Huh-7和HepG2增殖和凋亡作用的影响.方法:实验分为空白对照组、干扰无意义组、转染PBS组及干扰Rock2组.将Rock2干扰质粒shRock2转染到人肝癌细胞Huh-7和HepG2中,通过实时荧光定量PCR检测Rock2 mRNA的表达水平;Western blot检测Rock2蛋白的表达水平;MTT比色法检测沉默Rock2后对Huh-7和HepG2细胞增殖抑制的影响;流式细胞术检测沉默Rock2对Huh-7和HepG2细胞周期及早期凋亡的变化.结果:将shRock2转染肝癌细胞系Huh-7和HepG2后,Rock2 mRNA以及Rock2蛋白的表达水平均明显下降.沉默Rock2表达后,MTT结果显示Huh-7和HepG2细胞较对照组细胞增殖能力明显减弱(P＜0.01);Huh-7和HepG2细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);肝癌细胞的早期凋亡较对照组明显增加(P＜0.01).结论:沉默Rock2能明显抑制肝癌细胞系Huh-7和HepG2的增殖,并诱导其早期凋亡,提示Rock2可作为肝癌基因治疗的一个新的分子靶点.     

RNAi对大肠癌SW620细胞survivin基因的影响

目的：探讨RNAi（RNA interference）对survivin在大肠癌细胞SW620表达的影响及siRNA干扰后诱导肿瘤survivin表达降低的机制。方法：构建survivin特异性的RNA封闭性载体survivinl通过培养大肠癌细胞SW620，survivin封闭性载体转染SW620细胞；Hoechest染色大肠癌细胞，通过荧光显微镜观察细胞形态学情况；流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡情况。结果：DNA测序证实表达质粒构建成功，转染后的大肠癌细胞核明显可见凋亡小体；流式细胞仪分析大肠癌细胞系SW620的凋亡率survivinl为10．03％。结论：RNAi能够下调survivin，并促进大肠癌细胞系SW620的细胞凋亡。     

黄曲霉毒素B_1对肝癌细胞株SMMC-7721的作用研究

目的通过用黄曲霉毒素B1（AFB1）处理人肝癌细胞株SMMC-7721研究AFB1对SMMC-7721细胞生长的影响。方法①首先应用96孔板培养细胞,选择适宜的细胞接种密度进行实验。②应用不同浓度的黄曲霉毒素B120g/ml、10g/ml、5g/ml、2g/ml、1.0g/ml、0.1g/ml、0.01g/ml处理人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法绘制细胞生长曲线,观察黄曲霉毒素B1对肝癌细胞株SMMC-7721生长的影响。结果不同浓度的AFB1对肝癌细胞株SMMC-7721的影响不同,AFB120.0g/ml、AFB110.0g/ml、AFB15.0g/ml表现为细胞毒性,呈浓度依赖性;AFB11.0g/ml、AFB10.1g/ml、AFB10.01g/ml对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖活性具有促进作用,以AFB11.0ug/ml浓度显著,AFB10.1 g/ml、AFB10.01g/ml作用渐减弱。结论黄曲霉毒素B11.0g/ml具有增强人肝癌细胞株SMMC-7721增殖活性的作用。     

人参二醇组皂苷对小细胞肺癌细胞增殖的影响及其机制

目的:探讨人参二醇组皂苷对小细胞肺癌细胞增殖的影响及其机制.方法:在小细胞肺癌细胞的培养液中加入不同浓度(50～250mg/L)的人参二醇组皂苷,培养一定时间后,通过测定其中氚标胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入量(3H-TdR),及以MTT法来评定小细胞肺癌细胞增殖程度.同时,测定细胞培养液中超氧化物歧化酶(S0D)、脂质过氧化物水平,以反映细胞氧化还原状态.结果:随着人参二醇组皂苷浓度的增加,3H-TdR及MTT测定的0D值逐渐减少,细胞增殖率逐渐增加,SOD水平逐渐增加,丙二醛(MDA)水平逐渐减少.当人参二醇组皂苷浓度为150,200,250mg/L时,各指标与对照组(未用药)相比均具有显著性差异(P＜0.05).结论:人参二醇组皂苷可增加S0D水平,减少活性氧自由基的产生,抑制小细胞肺癌细胞的增殖.     

小细胞肺癌细胞系H446肿瘤细胞球培养方法的优化

目的:探讨优化体外培养小细胞肺癌细胞株H446肿瘤细胞球的方法。方法:利用干细胞无血清培养技术,观察H446细胞在下述不同培养条件下肿瘤细胞球的生长情况,并接种于超低吸附及非超低吸附培养板,调整细胞密度至1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL,采用针头吹打法和移液器吹打法将肿瘤细胞球制成单细胞悬液用以进一步传代。结果:(1)超低吸附培养板第2天形成明显肿瘤细胞球,非超低吸附培养板第10天出现肿瘤细胞球。(2)1×106/mL组每个高倍视野下约有7个肿瘤细胞球,每个细胞球约由几十个甚至上百个细胞组成。(3)针头吹打法传代后肿瘤细胞球活性和增殖能力明显优于移液器吹打法。结论:选择超低吸附培养板、1×106/mL密度接种和针头吹打法可有效分离肿瘤细胞球。     

脂质体介导的小发夹干扰RNA对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1表达的影响

目的:探讨脂质体介导的小发夹干扰RNA(shRNA)对卵巢癌顺铂耐药细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响。方法:设计合成针对ERCC1基因的小发夹干扰RNA(ERCC1-shRNA),构建携带ERCC1-shRNA的重组质粒表达载体,采用脂质体Lipofectamine 2000转染COC1/DDP细胞。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)检测转染后细胞中ERCC1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞计数检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:转染后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA表达较转染前明显降低(F=203.73,P<0.01),ERCC1蛋白表达亦显著下降。RNA干扰ERCC1基因后48h,COC1/DDP细胞的凋亡率较对照组有明显升高(t=20.65,P<0.01)。结论:构建的重组质粒表达载体转染COC1/DDP细胞可明显下调ERCC1 mRNA及蛋白的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。