构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

下调Pygo2抑制脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭及其cyclin D1的表达

目的构建RNA干扰(RNAi)重组体抑制Pygo2的表达,并探讨其对脑胶质瘤U251细胞增殖、侵袭的影响及其机制。方法针对Pygo2cDNA序列设计并合成一对特异性的含有短发卡的寡核苷酸序列及其阴性对照序列,经退火后插入pSuper中构建重组体。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染脑胶质瘤U251细胞,采用实时定量PCR和蛋白质印迹方法检测Pygo2shRNA对U251细胞Pygo2mRNA和蛋白表达的干扰效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布,BrdU掺入法检测DNA合成,Transwell检测细胞侵袭。采用蛋白质印迹和免疫荧光法检测Pygo2shRNA对U251细胞cyclin D1、β-catenin蛋白水平和亚细胞定位的影响。结果双酶切和测序鉴定证实插入序列完全正确;Pygo2shRNA显著抑制了U251细胞Pygo2mRNA和蛋白的表达;Pygo2shRNA抑制U251细胞Pygo2表达后,细胞增殖显著降低,细胞更多地阻滞在G1期,且BrdU掺入显著减少,侵袭细胞数显著减少。此外,抑制Pygo2表达可显著下调U251细胞cyclin D1的表达但不改变其亚细胞定位。U251细胞β-catenin表达及其亚细胞定位无明显改变。结论成功构建了抑制Pygo2表达的重组载体。抑制Pygo2表达能有效地抑制脑胶质瘤U251细胞DNA合成,可能通过下调Wnt信号靶基因cyclin D1的表达,使细胞阻滞于G1期而抑制细胞增殖和侵袭。     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.     

编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建Nogo受体(NgR)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行缺血性脑损伤的基因治疗研究奠定基础.方法:将前期构建的大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含NgR基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌.将pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、PCR产物测序及病毒滴度测定.结果:结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及DNA测序结果证明Adeno-U6-shRNA包被成功.结论:成功构建了大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体Adeno-U6-shRNA,将为应用基因沉默技术研究NgR在缺血性脑损伤后神经再生中的作用奠定基础.     

人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达

目的 构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1.观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达.方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Western blotting实验观察重组质粒的表达情况.结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1 cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1 cDNA序列一致.经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Western blotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.用脂质体2 000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线.结果 构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞.     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

靶向PTTG和survivin双干扰siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用.方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGene...     

趋化因子受体CXCR4小分子干扰RNA表达载体的构建及表达

目的： 构建趋化因子受体CXCR4小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，研究其对CXCR4基因表达的沉默效果，探索抗人免疫缺陷病毒-1 （HIV-1）治疗的新途径。方法： 根据软件设计针对CXCR4基因的siRNA序列，经退火成互补双链，克隆到Psilencer^M3.1-H1 neo载体中，经测序鉴定插入序列的正确性。转染MT₄细胞后，采用RT-PCR及流式细胞仪方法检测转染siRNA质粒的实验组、转染空载体的阴性对照组和空白细胞对照组间抑制基因表达情况。结果： PCR及琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒Psilencer^M 3.1-H1- siRNA neo，有正确的特异性片段，DNA测序也证明具有正确序列；该载体转染MT₄细胞48 h后，能明显抑制CXCR4基因表达，其表达抑制率为70%，与空白对照组和阴性组比较差异有显著性（P<0.05）。结论： 成功构建趋化因子受体CXCR4的siRNA表达载体。     

突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。     

人HSP_(70)真核表达载体的构建及在大鼠胶质瘤细胞内的表达

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的真核表达载体,并在大鼠胶质细胞瘤C6细胞中进行表达。方法:构建了HSP70与PCDNA3.1真核表达载体pCDNA3.1-HSP70,以脂质体法转染,同时利用免疫组织化学方法检测HSP70在大鼠胶质细胞瘤C6细胞中进行表达。结果:成功地构建了真核表达载体pCDNA3.1-HSP70,采用脂质体法转染大鼠胶质瘤C6细胞后,成功检测到HSP70在大鼠胶质细胞瘤C6细胞中表达。结论:成功地将外原性HSP70基因转染到大鼠胶质瘤C6细胞中并进行表达,为HSP70在肿瘤免疫治疗中的应用提供了实验材料。     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。     

选择性杀伤CEA阳性结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用

目的 构建能选择性杀伤表达癌胚抗原(CEA)的结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体.方法 PCR扩增CEA基因5'端调控序列,构建以EGFPLuc作为报告基因的表达质粒pCEA-EGFPLuc.利用脂质体将pCEA-EGFPLuc导入CEA阳性和阴性细胞中,通过检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达和荧光素酶(luciferase)活性,评价CEA启动子活性.构建由CEA启动子调控的E1A,并携带HSVtk基因的条件复制型腺病毒Ad.CEA-E1A/CMV-TK,分别感染CEA阳性肿瘤细胞(Lovo和SW620)和阴性肿瘤细胞(HeLa),通过E1A表达和细胞存活率检测,评价该病毒对CEA阳性肿瘤细胞的选择性杀伤效果及联合应用环氧鸟苷(GCV)后的协同效应.结果 CEA启动子具有较好的选择性和较高的活性.Ad.CEA-E1A/CMV-TK只在CEA阳性的肿瘤细胞中表达E1A.感染Ad.CEA-ElA/CMV-TK后,Lovo和SW620细胞的存活率分别为(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%,均显著低于HeLa细胞的(87.44±2.76)%(P<0.01);联合GCV对Lovo和SW620的杀伤效果增加,细胞存活率分别为(17.26±3.65)%和(23.93±5.40)%,显著低于未加GCV的(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%(P<0.01).结论 由CEA调控复制的Ad.CEA-E1A/CMV-TK对CEA阳性的结直肠癌细胞具有选择性杀伤作用,联合GCV后杀伤效果明显增强.     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

靶向EGFR基因siRNA腺病毒载体构建及其对EL-4影响

目的 构建含EGFR基因siRNA腺病毒载体,并研究其对EL-4细胞株中EGFR基因表达的影响.方法 合成双链寡核苷酸并克隆入pShuttleH1载体,pShuttleH1-siEGFR线性化后电转化到含pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中获取重组质粒,脂质体转染293细胞获取重组腺病毒Ad-siEGFR;TClD50法测定病毒效价;利用得到的重组腺病毒感染鼠EL-4细胞株,采用Western-blot检测感染前后EGFR蛋白表达水平的变化,观察AdHl/siEGFR对EL-4细胞EGFR表达的影响.结果 成功构建EGFRsiRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制EL-4细胞中EGFR蛋白的表达.结论 构建的AdHl/siEGFR腺病毒能有效抑制EGFR基因在EL-4细胞株中的表达,为胸腺瘤基因治疗提供了新的方法和材料.     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。     

卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白上游保守序列基因microRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建和鉴定卡氏肺孢子菌(Pneumoeystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glyeoprotein,MSG)表达调控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA表达载体,并在体外转染到PC中观察其对Pc的抑制作用.方法:设计并人工合成针对PC MSG-UCS基因的1对microRNA序列并定向克隆到表达载体pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR上,序列正确的载体用脂质体转染PC细胞,RT-PCR检测其对PC MSG-UCS基因的抑制作用,扫描电镜观察Pc的超微结构变化.结果:凝胶电泳和测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致.其在mRNA水平能明显抑制Pc的表达并能破坏PC的超微结构.结论:Pc MSG-UCS基因的microRNA表达载体pPC-UCSm构建成功,并能在体外抑制PC的表达.