黄芪注射液影响贫血小鼠粒单系、红系造血及作用机制的探讨

目的：研究黄芪注射液对贫血小鼠粒单系和红系血发生的影响,并探讨其作用机制。方法：制备贫血小鼠模型,随机分为给药组和对照组,采用造血祖细胞体外培养等实验血液学技术。结果：一定浓度的黄芪注射液体内作用可使贫血小鼠血清集落刺激因子（CSF）水平明显升高,刺激贫血小鼠粒单系、红系造血祖细胞增殖和分化以及骨髓基质细胞增殖,使降低的骨髓有核细胞（BMC）数以及外周血象明显回升,黄芪注射液和造血细胞直接一起孵育对粒单系祖细胞（CFU－GM）和红系祖细胞（CFU－E、BFU－E）的产率无明显影响。结论：一定浓度的黄芪注射液体内作用可促进贫血小鼠粒单系和红系造血功能恢复。     

中药复方制剂对再障红系造血祖细胞体外增殖的实验研究

本文应用造血祖细胞体外甲基纤素半固体培养方法，研究了中药复方制剂－固本生血丸对再障碍骨髓红系造血祖细胞体外集落形成的影响。结果表明：该制剂在有ＥＰＯ存在的条件，下对再生障碍性贫血病人骨髓红系造血祖细胞的集落形成具有促进作用；且在中药浓度为０．０１－１０μｇ／ｍｌ的浓度范围内，促增殖作用与中药浓度成正相关，作用高峰在１０μｇ／ｍｌ的中药浓度上，当浓度超过１０μｇ／ｍｌ时，促增殖作用不明显。单独应用该     

墓头回诱导脐血基质细胞生长促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的研究

目的 研究中药墓头回对脐血基质细胞促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的影响.方法 收集12例脐血单个核细胞(MNC),加入不同浓度的墓头回水提物共培养14天,基质细胞层形成后,消化,计数;收集基质细胞最多浓度的上清液(MTH-PSCS),以不同比例与MNC共同加入集落培养基中共培养14天,计数粒-单系和红系造血祖细胞集落数.结果 0.01μg/ml的墓头回与MNC共孵育14天后,基质细胞的数量(14±2.8)×105/ml明显多于对照组(9±2.2)×105/ml.0.01 μg/ml的MTH-PSCS以0、5、10、20比例作用后,脐血粒-单系造血祖细胞集落数分别为17±6、121±24、268±27、114±31、68±11,10%的MTH-PSCS作用最为明显;脐血红系造血祖细胞集落数分别为38±12、72±23、81±9、159±45、90±32,其中以20%的MTH-PSCS作用最为明显.结论 中药墓头回可诱导脐血基质细胞的生长,可以促进粒-单系和红系造血祖细胞集落的形成.     

成骨生长肽对红系造血祖细胞的体外促增殖作用

目的：通过研究人工合成成骨生长肽(sOGP)对红系造血祖细胞的体外促增殖作用，初步探索sOGP促造血活性的作用环节。方法：将正常小鼠和人骨髓有核细胞在标准红系祖细胞基础培养基中进行培养，设定sOGP的不同浓度梯度，于培养48h后计数小鼠CFU—E集落数，培养第4天与第14天计数人CFU—E、BFU—E集落数，将数据与空白对照组及EPO阳性对照组进行比较。结果：sOGP能够有效促进小鼠CFU—E及人CFU—E、BFU—E的体外增殖，量效关系明显，其有效作用浓度范围为10^-16～10^-10mol／L，高峰浓度约为10^-14～1011^-12 mol／L，呈低浓度、广范围及双相作用的特点。但是，sOGP对红系造血祖细胞的体外促增殖效果要弱于阳性对照药EPO。结论：sOGP能够在体外有效地促进红系造血祖细胞的增殖，可能是通过对骨髓基质细胞的作用而促进造血和造骨。     

放烧复合伤小鼠骨髓基质细胞对粒-巨噬系祖细胞生长的影响

为了进一步阐明放射损伤复合烧伤(放烧复合伤)时骨髓造血基质细胞支持粒-巨噬系祖细胞造血能力的变化,采用小鼠骨髓基质细胞体外融合培养和粒-巨噬系祖细胞集落(CFU-GM)培养的方法,观察了5Gy照射复合15％Ⅲ度烧伤时基质细胞对支持CFU-GM生长的影响。结果表明:①单纯5Gy照射,单纯烧伤及放烧复合伤后,其骨髓基质细胞支持正常粒-巨噬系祖细胞造血的能力明显下降,以伤后3-5天最为显著,伤后10天仍未恢复至正常;②当骨髓基质细胞和粒-巨噬系祖细胞均受到致伤因素作用时,单纯照射及放烧复合伤组的CFU-GM形成能力下降更为明显,至正常对照组的10％以下,单纯烧伤组也有明显下降,但恢复较快;③在本研究所涉及的各种情况下,损伤的效应均有伤后3-5天达最低值的规律,之后可不同程度地恢复。实验结果提示,在上述损伤因素的作用下骨髓基质细胞的功能确已受到了不同程度的损伤,因此在治疗由此所引起的造血功能障碍时,同时加强促进基质细胞修复的措施,可能会取得更满意的疗效。     

骨髓基质细胞对粒系祖细胞增殖的影响

本文研究了培养不同时间的骨髓基质细胞对粒系祖细胞体外培养生长的影响,并分析其细胞成分及培养上清液的作用。结果表明:在含上清的基质细胞贴壁层上种植骨髓细胞,除第14天外,均可见对CFU-GM的形成有刺激作用。而单纯无上清贴壁细胞层,或单纯基质贴壁细胞培养上清液,均无此刺激作用。说明基质细胞对粒系造血祖细胞生长的调控必须在一个结构功能完整的体系中才能发挥作用。在无外源性CSF作用的情况下,基质细胞仍能使少量CFU-GM生长,也说明基质细胞有刺激粒细胞生长的作用。14天以前,无琼脂间隔层的粒系祖细胞数较高,而21天后,有琼脂间隔层的粒系祖细胞数较高。说明造血基质细胞对粒系细胞生长的调控受着多方面因素的影响,体外培养时间不同有不同表现。基质细胞一方面通过与粒系造血祖细胞相互作用,近距离调节,另方面通过分泌粒系刺激因子和抑制因子,从正、负两方面调节粒系造血,以维持粒系造血的动态平衡。     

原发性再生障碍性贫血病人外周血单个核吞噬细胞抑制正常CFU-C生长

作者曾发现从再生障碍性贫血病人骨髓中除去单个核吞噬细胞后骨髓的GM—CFU生成有明显升高,提示患者骨髓中的吞噬细胞可能有抑制粒系定向干细胞的增殖分化作用。为探索原发性再障外周血单个核吞噬细胞在粒系造血中的可能作用,作者研究了20例原发性再障病人外周血单个核细胞对正常骨髓CFU—C生长的影响。     

小鼠胎盘间充质干细胞移植对造血系统自然衰老的影响

背景：造血系统作为人体重要组成部分,随着年龄的增长会出现功能不断衰退。目的：观察小鼠胎盘间充质干细胞对小鼠造血系统自然衰老的延缓作用。方法：取孕13.5dBalb/c小鼠胎盘,制备胎盘间充质干细胞。6月龄Balb/c小鼠48只随机分均为细胞移植组和对照组。细胞移植组尾静脉输注胎盘间充质干细胞,每月1次,共6次;对照组输注生理盐水。第3个月进行外周血象、骨髓有核细胞计数、成纤维细胞集落培养、造血祖细胞集落培养和外源性脾集落形成单位计数检测;第6个月时增加骨髓切片观察、骨髓细胞重建造血能力测定。结果与结论：细胞移植组小鼠一般情况优于对照组;干预第3个月,细胞移植组的骨髓有核细胞计数、巨噬系祖细胞、巨核系祖细胞多于对照组,其他指标无明显差别;干预第6个月,除外周血象仍无差别外,其他的上述指标均明显高于对照组;观察期内两组的上述指标均随时间延长呈下降趋势,但细胞移植组下降速度明显慢于对照组,差异有显著性意义（P〈0.05）。组织学观察发现,细胞移植组骨髓造血组织较对照组丰富,而对照组骨髓脂肪化显著增加;实验还发现细胞移植组骨髓细胞的造血重建能力明显优于对照组。结果提示,小鼠胎盘间充质干细胞能够延缓小鼠造血系统的衰退。     

血管内皮细胞与造血

血管内皮细胞（ＶＥＣ）是造血诱导微环境中重要的基质细胞成分。未受刺激的ＶＥＣ对粒系、巨核系和早期红系祖细胞似有一定促进作用，经诱导物刺激后，其调控作用加强。ＶＥＣ培养上清液可改善肿瘤化疗所致的造血抑制。     

IL—6基因转染的骨髓基质细胞系对骨髓移植小鼠造血功能恢复？…

目的：探讨白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转染的骨髓基质细胞系ＱＸＭＳＣ１ＩＬ－６对骨髓移植后造血功能的重建作用。方法：将骨髓造血细胞和骨髓基质细胞系一起经尾静脉注射给同系小鼠，建立骨髓移植（ＢＭＴ）模型。小鼠的造血功能用脾结节（ＣＦＵ－Ｓ）、粒－单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）、红系祖细胞（ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ）测定及外周血各项血液学指标来确定。结果：ＷＸＭＳＣ１ＩＬ－６转基因骨髓基质细胞可明显增强ＢＭ     

骨髓基质细胞促进γ射线照射小鼠的造血恢复

用体外骨髓贴壁细胞长期传代法,建立一株骨髓基质细胞QXMSC1,经鉴定可能为巨噬细胞来源。用5Gyγ射线照射BALB/c小鼠建立造血功能缺损动物模型,将QXMSC1细胞输入到照射小鼠体内,用半固体琼脂法测定粒-巨噬系祖细胞,甲基纤维素法测定红系祖细胞,血细胞自动计数仪测定外周血各项血液学指标。结果表明,在照射后第10天,骨髓基质细胞可增加辐射损伤小鼠骨髓有核细胞数,增加CFU-GM,CFU-E和mBFU-E集落数。在照射后第20天,可促进外周血WBC,RBC,Hct和Hb的恢复。说明骨髓基质细胞QXMSC1可促进辐射损伤小鼠造血功能恢复。此外,QXMSC1细胞条件培养上清液具有刺激体外CFU-GM集落生长的作用。     

烧伤大鼠血清对骨髓红系粒系造血的影响

目的：观察烧伤血清对骨髓红系粒系造血的影响，探讨促进造血细胞增殖的物质。方法：用5kg溴钨灯致大鼠背部30％体表面积Ⅲ度烧伤，伤后无菌抽取大鼠血清。按10mg／L蛋白加入到骨髓红系或粒系体系中培养。结果：烧伤后3，12，24，48，72和96h，骨髓红系(CFU-E，RFU-E)和粒分(CFU-GM)集落数均显著高于正常对照组：伤后24h达3377，179．7，2405个／1&;#215;10^5骨髓有核细胞(bone marrow cell,BMC)；对照组仅98．5，68．7，1052个／1&;#215;10^5BMC；差异非常显著(t=8．3l，9．65，7．84，P&;lt;0．01)结论：烧伤血清对骨髓红系、粒系造血均有明显的促进作用。     

骨髓增生异常综合征患者血清造血抑制活性的研究

目的　探讨骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ） 患者血清对正常骨髓粒系及红系造血祖细胞的抑制作用。方法　应用甲基纤维素体外培养法,以ＤＮＡ 末端标记及流式细胞术分析观察患者血清体外抑制正常人骨髓造血祖细胞增殖及对正常人造血细胞凋亡的作用。结果　２３ 例患者中有３ 例的血清具有抑制正常骨髓粒系祖细胞生长的作用,４ 例血清具有抑制正常骨髓红系祖细胞生长的作用。４例对正常骨髓红系祖细胞生长有抑制作用的患者中有３ 例患者血清的抑制活性可被抗肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）单克隆抗体中和。２ 例具有抑制正常骨髓红系祖细胞生长活性的血清在体外可促进正常骨髓造血细胞凋亡。结论　部分ＭＤＳ患者血清中存在造血抑制因子,这种抑制因子主要是ＴＮＦα,ＴＮＦα诱导造血细胞凋亡是致部分ＭＤＳ患者无效造血的重要原因     

脐血单个核细胞与骨髓间充质干细胞滋养层的共培养

背景:骨髓间充质干细胞具有维持骨髓正常造血功能,在造血调控中发挥重要的作用。目的:观察骨髓间充质干细胞的生物学性状和多向分化能力,并检测其在体外支持造血的能力。方法:利用密度梯度培养法分离骨髓单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型;接种脐血单个核细胞于骨髓间充质干细胞滋养层培养板上共培养,观察粒-单系祖细胞集落变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维样细胞形态,强表达CD44,CD29,不表达CD34和CD106。可促进脐血单个核细胞扩增并形成造血祖细胞集落。提示骨髓间充质干细具有造血支持作用。     

血管内皮细胞与造血

血管内皮细胞(VEC)是造血诱导微环境中重要的基质细胞成分。未受刺激的VEC对粒糸、巨核系和早期红系祖细胞似有一定促进作用,经诱导物刺激后,其调控作用加强。VEC培养上清液可改善肿瘤化疗所致的造血抑制。     

采用多功能流式细胞术分析分选造血干细胞和髓系定向分化祖细胞

目的 探讨富集纯化造血干细胞(HSC)和髓系定向分化祖细胞的新实验方案.方法 根据造血干细胞和定向分化祖细胞在发育过程中表达某些特异性分化抗原的特性,通过免疫磁珠分选技术结合四色和六色流式细胞术分析14只健康小鼠的骨髓造血干细胞、造血祖细胞及定向分化祖细胞系列的表达,并对其进行分选,以进一步通过集落细胞培养和传代试验对分选后细胞的活性进行检测.结果 经上述实验方案分析,14只健康小鼠骨髓造血祖细胞(HPC)的表达率约为HSC的10倍;但其牛成活性远不如造血干细胞,共同髓系祖细胞(CMP)的传代能力仅为HSC的1/2,且次级分化的粒系单核系祖细胞(GMP)和红系巨核系祖细胞(MEP)的生成活性更弱,其传代次数为零.结论 通过多色流式细胞术实验方案可以分析纯化HSC和髓系定向分化祖细胞的表达,并精确计数HSC和祖细胞.     

小鼠胎盘间充质干细胞移植对造血系统自然衰老的影响

背景:造血系统作为人体重要组成部分,随着年龄的增长会出现功能不断衰退。目的:观察小鼠胎盘间充质干细胞对小鼠造血系统自然衰老的延缓作用。方法:取孕13.5dBalb/c小鼠胎盘,制备胎盘间充质干细胞。6月龄Balb/c小鼠48只随机分均为细胞移植组和对照组。细胞移植组尾静脉输注胎盘间充质干细胞,每月1次,共6次;对照组输注生理盐水。第3个月进行外周血象、骨髓有核细胞计数、成纤维细胞集落培养、造血祖细胞集落培养和外源性脾集落形成单位计数检测;第6个月时增加骨髓切片观察、骨髓细胞重建造血能力测定。结果与结论:细胞移植组小鼠一般情况优于对照组;干预第3个月,细胞移植组的骨髓有核细胞计数、巨噬系祖细胞、巨核系祖细胞多于对照组,其他指标无明显差别;干预第6个月,除外周血象仍无差别外,其他的上述指标均明显高于对照组;观察期内两组的上述指标均随时间延长呈下降趋势,但细胞移植组下降速度明显慢于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。组织学观察发现,细胞移植组骨髓造血组织较对照组丰富,而对照组骨髓脂肪化显著增加;实验还发现细胞移植组骨髓细胞的造血重建能力明显优于对照组。结果提示,小鼠胎盘间充质干细胞能够延缓小鼠造血系统的衰退。     

人巨细胞病毒感染致造血祖细胞增殖抑制与更昔洛韦的影响术

背景：临床研究显示，骨髓移植后人巨细胞病毒感染可阻碍血小板植入、出现表型异常的外周血白细胞，导致骨髓移植失败，这可能是由于人巨细胞病毒感染直接影响了造血祖细胞所致。目的：观察更昔洛韦对人巨细胞病毒感染所致脐血粒一巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞体外增殖抑制的影响及更昔洛韦对此的保护作用。设计：对比观察性实验。单位：泸州医学院附属医院分子生物学实验室。对象：正常足月顺产新生儿脐血标本20例，每份10mL。由泸州医学院附属医院妇产科提供，产妇对本实验知情同意。实验经医院伦理委员会批准。方法：实验于2004-06／2006-12在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成。采用脐血标本造血祖细胞培养技术，观察、计数100TCID50人巨细胞病毒-AD169感染粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞后各祖细胞集落数，记录集落维持时间。用PCR和荧光定量PCR技术检测集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。将7．5mg/L更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的造血祖细胞，再分别计集落数、集落维持时间及集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。设正常培养的造血祖细胞为空白对照组，设与含灭活性人巨细胞病毒的正常造血祖细胞培养系统为灭活对照组。主要观察指标：①祖细胞集落数、祖细胞集落维持时间。②祖细胞集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。结果：①集落数和集落维持时间：人巨细胞病毒感染的祖细胞集落数较对照组明显减少（P〈0．01），集落维持时间较对照组明显缩短（P〈0．01）。在人巨细胞病毒感染的集落细胞内检测到人巨细胞病毒-DNA的存在：更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的祖细胞后，与人巨细胞病毒感染的祖细胞比?     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

鸡血藤活性成分SS8对骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖的作用

背景：机体造血调控的关键在于造血干细胞和造血祖细胞，被抑制的造血干／祖细胞的增殖、分化、成熟和释放中的任何一个环节的增强，都可以促进机体造血功能的恢复。目的：分析鸡血藤活性成分SS8对骨髓抑制小鼠粒单系造血祖细胞、红系造血祖细胞、巨核系造血祖细胞增殖的影响。设计：随机对照实验。单位：中国人民解放军总医院临床药理研究室。材料：实验于2002-02／2002-06在解放军总医院药理研究室完成。选取健康昆明种小鼠20只，随机分为正常组、对照组、SS8高剂量组、SS8中剂量组、SS8低剂量，4只／组。方法：除正常组外，其余各组小鼠均以％01射线全身亚致死量辐射（照射率210．6Rnt／min，照射剂量400cGy／min，照射时间110．7s），于照射后当天正常组和对照组腹腔注射无菌注射用水，SS8高、中、低剂量组分别腹腔注射0．4，0．08，0．016g／L鸡血藤活性成分SS8，1次／d，连续给药21d。给药后第3，7，14，21天时分别行颈椎脱位法处死小鼠，收集股骨骨髓造血祖细胞，采用甲基纤维素半固体培养法，对长期接受SS8治疗后的骨髓抑制小鼠的造血祖细胞进行体外培养。主要观察指标：各组粒单系造血祖细胞、红系造血祖细胞、各组爆式红系造血祖细胞、各组爆式红系造血祖细胞的集落生长情况。结果：实验纳入20只小鼠全部进入结果分析。①各组粒单系造血袒细胞集落生长情况：给药后3d，正常组粒单系造血祖细胞集落数为（180．67&;#177;5．03）个，SS8高、中、低剂量组与对照组基本相似[（0．75&;#177;0．96），（1．75&;#177;0．50），（1．75&;#177;0．96），（1．75&;#177;0．96）个；t=1．8477。P=0．1141：t=1．4731，P=0．1911；t=1．4731，P=0．1911]；给药后21d，SS8低剂量组与对照组基本持平[（43．60&;#177;2.07），（47．00&;#177;3．92）个；t=1．5340，P=0．1759]，SS8中、高剂量组均明显高于对照组[（90．60&;#177;3．36），（93．00&;#177;3．16），（47．00&;#177;3．92）个;t=16．8896，P〈0．05；t=18．2718，P〈0．05]。②各组红系造血祖细胞集落生长情况：给药后3d，对照组和SS8高、中、低剂量组与正常组比较，红系造血祖细胞数目明显降低；至给药后7d，各组均开始恢复；给药后21d，SS8低剂量组与对照组基本相似[（44．50&;#177;1．29），（42．67&;#177;7．23）个；t=0．5119，P=0．6305]，SS8中、高剂量组均明显高于对照组[（62．50&;#177;2．08），（93．25&;#177;3．10）．（42.67&;#177;7．23）个，t=5．3553，P〈0．05；t=12．8223，P〈0．051。③各组爆式红系造血祖细胞集落生长情况：给药后3d，对照组和SS8高、中、低剂量组爆式红系造血祖细胞均降至最低，分别为（1．00&;#177;1．00），（7．00&;#177;1．00），（6．00&;#177;2．00），（6．00&;#177;2．00）个，但SS8高、中、低剂量组仍高于对照组（P均〈0．05）；给药后21d，SS8低剂量组仍与对照组相似[（5．00&;#177;1．82），（3.00&;#177;0．82）个；t=2．0038，P=0．0919]，SS8中、高剂量组均明显高于对照组[（15．25&;#177;2．50），（16．25&;#177;1．71），（3．00&;#177;0．82）个；t=9．3119，P〈0．05；t=13．9735，P〈0．01]。④各组巨核系造血祖细胞集落生长情况：给药后3d．由于照射后小鼠骨髓造血祖细胞的增殖能力明显受损，SS8高、中、低剂量组及对照组巨核系造血祖细胞数目较正常组显著降低，但SS8高、中、低剂量组仍高于对照组[（2．67&;#177;0．58），（1．33&;#177;0．58），（1．33&;#177;0．58），（0．33&;#177;0．58）个]，且SS8高剂量组与对照组比较有显著性差异（t=4．9412，P=0．0078）；给药后21d，SS8高、中、低剂量组均明显高于对照组[（2．50&;#177;0．58），（2．00&;#177;0．32）．（1．50&;#177;0．58）．（1．00&;#177;0．52）个；t=3．8512，P=0．0084；t=0．9753．P=0．3617；t=1．2837，P=0．2466]。结论：鸡血藤活性成分SS8低剂量对骨髓抑制小鼠造血祖细胞的增殖无显著刺激作用，而中、高剂量均可显著升高骨髓抑制后粒单系造血祖细胞、红系造血祖细胞、巨核系造血祖细胞集落产率，且随时间的延长刺激作用逐渐加强，且高剂量的刺激作用明显优于中剂量。提示造血祖细胞的增生是机体造血的重要环节，鸡血藤活性成分SS8对骨髓抑制小鼠造血祖细胞的增殖有明显刺激作用。