四种分枝杆菌快速检测方法的研究

目的 建立敏感、特异的快速检测4种分枝杆菌的方法。方法 用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性和特异性。将上述4种分枝杆菌的特异性引物同时放入PCR扩增反应体系中,以此反应体系分别对该4种分枝杆菌菌悬液DNA、及其两两组合或特定的三重组合进行扩增,同时验证其敏感性。结果 4种分枝杆菌的特异性引物分别放入各自的PCR扩增反应体系中,可分别特异性地扩增出该4种分枝杆菌对应的DNA片段,敏感性达1×10¹～1×10²个菌细胞/mL。4种分枝杆菌的特异性引物同时放入同一PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出对应的4种分枝杆菌单菌及其两两组合或三种分枝杆菌组合的DNA片段,敏感性达1×10²～1×10³个菌细胞/mL;4种分枝杆菌的特异性引物对其他分枝杆菌进行扩增,结果均为阴性。结论 多重PCR方法能敏感、特异地快速检测4种分枝杆菌。     

种特异性引物鉴定申克孢子丝菌

目的 研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法 对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果 序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论 应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.     

真菌特异性通用引物的聚合酶链反应系统的实验与临床研究

目的　为了判断临床和实验室标本中是否存在病原性真菌。方法　设计了一个以热启动聚合酶链反应 (PCR)为基础的实验方法 ,以一段真菌特异性DNA序列作为通用引物进行检测。引物序列为 :①AACTTAAAGGAATTGACGGAAG ;②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC。结果　该法能在 3小时之内对所用的全部 2 3种共 42株重要病原性真菌及经培养证实有真菌的 2 2份临床标本成功地扩增出一条310bp的DNA片段 ,但对其它微生物和人体细胞均未扩增出类似片段。该法敏感性高 ,特异性强。结论　采用通用性强的引物系统配合特异性高的热启动PCR技术检测临床和实验室标本中是否存在病原性真菌的方法有重要的应用潜力。     

常见致病性念珠菌的PCR-RFLP鉴定研究

目的 研究常见致病性念珠菌的分子鉴定方法,为深部念珠菌病的分子诊断奠定基础。方法 对常见9种致病性念珠菌的11株标准株和39株临床株的核糖体DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应扩增,对扩增产物进行MspⅠ、HaeⅢ和DdeⅠ三种内切酶的酶切分析。结果 9种念珠菌聚合酶链反应扩增后产生5种不同分子量的条带,扩增产物经MspⅠ、DdeⅠ和HaeⅢ酶切后分别产生8种、5种和4种特异性带型。结论 聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性方法在鉴定常见的致病性念珠菌中稳定、可靠、特异,是传统方法的有益补充。     

鸟分支杆菌聚合酶链反应检测的研究

目的 建立敏感性高、特异性强的快速检测鸟分支杆菌的方法.方法 用特异性引物对连续稀释的鸟分支杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性;并用该引物对除鸟分支杆菌外的其他17株分支杆菌DNA进行扩增,验证其特异性;将正常皮肤组织与鸟分支杆菌的菌悬液混合以模拟临床皮肤感染标本,初步探讨适宜的临床标本前处理的方法,以提高PCR方法在检测临床皮肤组织感染中的敏感性.结果 PCR方法可扩增427bp的鸟分支杆菌DNA片段,敏感性达1×10²个菌细胞/mL,对其他分支杆菌进行扩增,结果均为阴性.对模拟临床皮肤感染标本进行PCR检测,敏感性降低为1×10⁴个菌细胞/mL;将组织匀浆连续倍比稀释后,再加入细菌悬液,结果当组织匀浆稀释度≥1:4时,PCR的敏感性提高到1×10²个菌细胞/mL.结论 PCR方法能敏感、特异地快速检测鸟分支杆菌.     

检测泌尿生殖道感染常见性病病原体基因芯片的构建

目的 建立检测泌尿生殖道性传播感染常见病原体的基因芯片技术。方法 首先将9种目的病原体分为病毒、细菌及低级真核生物三类,分别设计1对荧光标记的通用引物,利用多重PCR技术使3对引物置于同一反应体系进行扩增,再将特异性探针点样于玻片上制备成基因芯片,与扩增产物进行杂交、扫描并分析结果。结果 单重PCR和多重PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳均可见相应的阳性条带。扩增产物与基因芯片杂交后扫描,各病原体均可见荧光信号,与所对应的特异性探针位置相吻合。结论 本研究初步构建的基因芯片技术具有特异、灵敏、快速及能一次性同时检测多种病原体的特点。     

PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定

目的 用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种。方法 应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增，扩增产物经ABI PRISM^TM377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小，与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果 ①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同)。②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近，差异无显著性。③整个检定过程仅需6h。结论 采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法，结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种，这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法。     

12株马内菲青霉随机扩增DNA多态性研究

目的 了解马内菲青霉的基因学特征,为该菌的DNA分型提供依据。方法 采用氯化苄提取法提取基因组DNA.用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对12株临床分离的马内菲青霉菌株进行DNA指纹图谱分析。结果 ①共选用40个随机引物进行扩增,筛选出4个具有稳定、清晰DNA扩增带型的引物。即引物P₂₃:5'-AGTCAGCCAC-3',P₁₀₃:5'-AGACGTCCAC-3',P₁₀₅:5'-AGTCGTCCCC-3',P₁₂₀:5'-GGGAGACATC-3'.②12株菌株DNA图谱主要带型相同,扩增片段呈多态性。相似率44.4%～97.3%.③12株菌可分5个不同的组群。结论 RAPD技术可以用于马内菲青霉的基因分型。     

马尔尼菲青霉临床分离株的rDNA ITS序列分析

目的 为设计马尔尼菲青霉种特异性引物,探讨马尔尼菲青霉病更加确切的诊断方法.方法 实验菌株为北京大学真菌和真菌病研究中心保存的4株马尔尼菲青霉,来源于国内不同地区.用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增马尔尼菲青霉rDNAITS,扩增产物纯化后直接测序,测序结果在基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索,并依据序列对比、分析.结果 4株临床分离的马尔尼菲青霉的rDNA ITS序列相同.与国外来源于美国、印度尼西亚、法国、澳大利亚的马尔尼菲青霉rDNA ITS序列基本一致.马尔尼菲青霉与荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、念珠菌的rDNAITS序列差异较大,青霉和曲霉属间rDNAITS的序列相似性较低,而青霉种间rDNAITS序列的差异不大.结论 不同来源的马尔尼菲青霉菌株间乃至不同青霉的种间的rDNA ITS序列均具有较高的同源性,提示该区可能不适于作为靶基因来设计马尔尼菲青霉的种特异性引物或探针.     

PCR-RFLP分析鉴定皮肤组织中的分枝杆菌

目的 探讨用PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中分枝杆菌。方法 皮肤感染性肉芽肿患者组织标本9份.提取组织DNA,进行PCR扩增,PCR产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ2种限制性内切酶进行酶切,3%Nusieve 3:1琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性分析,并与培养结果进行比较。结果 从5份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分枝杆菌,从另4份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出2份结核分枝杆菌和2份脓肿分枝杆菌,此9份结果与培养鉴定结果完全一致。结论 用PCR-RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿组织中的分枝杆菌。     

PCR检测深部致病真菌感染的研究

目的探讨PCR在可疑深部真菌感染临床标本检测中的应用。方法对60份临床标本分别进行传统真菌培养以及真菌通用引物PCR和三重PCR检测。结果真菌培养阳性共19份，其中白念珠菌10份、烟曲霉2份、新生隐球菌2份、其他菌株5份（包括光滑念珠菌2份、热带念珠菌2份、克柔念珠菌1份）；真菌通用PCR检测共有21份阳性，经三重PCR检测共有15份阳性，分别为白念珠菌10份、烟曲霉3份、新生隐球菌2份。PCR方法与传统培养方法相比，检出率差异无统计学意义。结论PCR检测可疑深部真菌感染临床标本快速简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。     

二次PCR用于临床标本真菌感染快速分子诊断的研究

目的 探讨二次PCR技术诊断疑似真菌感染临床标本的敏感性。方法 收集临床疑似真菌感染的深部位痰及肺泡灌洗液标本共29份,分别进行真菌直接镜检、真菌培养、真菌通用引物单次与二次PCR扩增rDNA的ITS区,并对真菌检出阳性率和多种真菌菌种检出率进行比较分析。结果 临床疑似病例痰及肺泡灌洗液标本真菌镜检、真菌培养、单次PCR和二次PCR真菌检出阳性率分别为20.7%（6/29）、37.9%（11/29）、17.2%（5/29）和48.3%（14/29）。真菌培养、单次PCR和二次PCR提示二种以上真菌菌种检出的比例分别为6.9%（2/29）、3.4%（1/29）和24.1%（7/29）。二次PCR与单次PCR的真菌检出率差异有统计学意义（χ2 = 6.34,P < 0.05）。在两种以上菌种检出率方面,二次PCR与真菌培养和单次PCR间差异均有统计学意义（χ2 = 4.09,6.30,P值均 < 0.05）。结论 二次PCR技术有助于提高临床标本真菌分子诊断的敏感性。     

聚合酶链反应快速检测丝状真菌

目的　建立并评价一种新的丝状真菌的快速PCR检测方法。方法　将 13种培养的不同丝状真菌菌种经匀浆器研磨处理后直接放入一个新建立的PCR体系 ,用 2对真菌通用引物进行PCR扩增。结果　 13种不同的丝状真菌菌种均在 2h内通过该PCR方法成功地获得了靶DNA的扩增 ,无需任何DNA抽提步骤 ,可用于直接扩增处于任何生长期的未经处理的丝状真菌DNA。结论　此法简便、快速 ,敏感性、特异性均高 ,对丝状真菌引起的深部真菌感染的早期诊断将具潜在意义。     

基因释放剂在快速制备医学真菌DNA中的应用

目的 评价基因释放剂在快速制备医学真菌ＤＮＡ中的作用和应用条件。方法 样品加入基因释放剂后分别用程序加热法、微波处理法和煮沸法处理，然后用１８ｓｒＤＮＡ通用引物进行ＰＣＲ扩增。优化ＰＣＲ扩增体系和条件。结果 ３种方法均能达到实验要求，其中以微波处理法中的５档火力７ｍｉｎ条件效果最好，各菌株均可被扩同一条４８２ｂｐ的ＤＮＡ带。敏感性为１０＾１个孢子／ｍｌ。结论 使用基因释放剂可简便快速从小量致病真菌     

PCR法和传统方法对体液标本中致病真菌的检测比较

目的评价PCR方法诊断深部真菌感染的敏感性和特异性。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对83例临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速检定,并与传统方法检验的结果进行比较。结果直接PCR扩增的阳性率与传统方法差异无统计学意义。结论采用ITS通用引物PCR法可准确、特异、快速、敏感地检测深部致病真菌。     

Sensitive detection and typing of Chlamydia trachomatis using nested polymerase chain reaction.

OBJECTIVES--A method based on a nested polymerase chain reaction (PCR) was developed to detect and to type Chlamydia trachomatis from low titre samples by amplifying a large portion of the major outer membrane protein gene. The sensitivity of this procedure was evaluated in urogenital clinical samples in comparison with culture. SPECIMENS--A series of 787 urogenital specimens, including 37 (4.7%) positive by culture, together with 227 other samples that had been found to yield less than 25 chlamydial inclusions in culture were tested. METHODS--Samples were pelleted, resuspended in 1 mM NaOH, heated and amplified without further purification. After 40 cycles of PCR, 1 microliters of product was amplified by a further 30 cycles of PCR using a second set of primers nested within the initial pair. Positives were detected by agarose gel electrophoresis and confirmed by repeating the PCR analyses and determining the serovar of both amplified samples by restriction fragment length polymorphism. RESULTS--Nested PCR allowed detection of 96% and culture 77% of positives with only three samples repeatedly positive by PCR but considered false positives because a different serovar was identified in the two amplifications. Of culture-positive samples with less than 11 chlamydia inclusion-forming-units 97% could be detected by nested PCR and most still gave a positive signal when diluted hundred fold. CONCLUSIONS--Nested PCR provided the basis for a very sensitive C trachomatis detection and typing strategy. Repetition and typing positive samples facilitated detection of false-positive PCR specimens resulting from contamination of the PCR process or any reagent except the original sample.     

多重PCR结合反向线点杂交方法检测七种性病病原体

目的 建立多重PCR结合反向线点杂交技术同时检测淋球菌、 沙眼衣原体、生殖支原体、人型支原体、微小脲原体、解脲脲原体和毛滴虫的方法。方法 设计7对生物素标记的上述病原体特异性引物同时扩增病原体靶基因。扩增产物与预先标记在尼龙膜上的特异性探针杂交、显影，判读结果。多重PCR结合反向线点杂交方法检测211个尿道、宫颈分泌物临床标本（男107例，女104例），并与传统单一引物PCR检测结果比较，评价反向线点杂交的敏感性和特异性。结果 多重PCR结合反向线点杂交技术能敏感和特异地检测所有这7种病原体标准株，能敏感地检测病原体100拷贝的靶基因。在211个临床标本的检测中，2.8% （6 /211）的标本使用多重PCR结合反向线点杂交技术检测为阳性，而单一引物PCR检测为阴性，再使用巢式PCR检测这6个标本，结果为阳性。结论 多重PCR结合反向线点杂交技术能快速、敏感和特异地检测多种性病病原体。     

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的：应用内转录间隔区（ITS）通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法：采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种（8株）念珠菌菌县液进行PCR扩增。结果：两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌县液扩增出种特异的DNA多带，而第2对引物其种特异性更强。结论：采用ITS通用引物结合快速PCR检测法，可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。     

基因芯片技术检测生殖器溃疡性性病病原体

目的建立检测引起生殖器溃疡性性病病原体的基因芯片技术。方法设计并合成各病原体特异性探针，用点样仪将合成的特异探针点于玻片介质上，并经过点样后处理制备成基因芯片；荧光标记各病原体标准株及临床标本的特异靶基因，进行基因芯片杂交、扫描并分析结果。结果各病原体均可见特异的基因芯片荧光杂交信号：单一病原体出现一种特异荧光信号；混合病原体的不同组合出现相应组合的特异荧光信号。对40例生殖器溃疡临床标本进行芯片杂交检测，并与暗视野显微镜 聚合酶链反应(PCR)及HSV培养 PCR结果比较，具有较好的一致性(K值分别为0．882和0．947)。另外发现混合感染2例。结论本研究初步建立的基因芯片技术具有准确、特异及同时检测多重感染的特点。