LHRH-MPG△NLS/siRNA纳米复合物的制备及稳定性观察

目的设计并合成新型小干扰RNA(siRNA)载体促黄体激素释放激素-MPG△NLS(LHRH-MPG△NLS),考察不同N/P情况下LHRH-MPG△NLS与siRNA结合情况并探索稳定的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物的制备方法。方法将LHRH-MPG△NLS与针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的siRNA按N/P比为4∶1、6∶1、10∶1、12∶1的比例通过静电作用结合,制备多肽/siRNA复合物,并用琼脂糖凝胶电泳检测多肽与siRNA的结合情况。分别在pH值为7.0、7.5、8.0、8.5的溶液中制备N/P为20∶1的多肽/siRNA复合物,另在pH为7.0时按N/P为10∶1、15∶1、20∶1制备多肽/siRNA复合物,BI-9000AT激光光散射仪分别检测其16 d和20 d内粒径大小变化情况,考察其稳定性。结果LHRH-MPG△NLS与siRNA在N/P大于10∶1时形成完全结合的复合物,即siRNA被多肽完全包裹。不同pH值溶液中形成的多肽/siRNA复合物稳定性没有明显的差别,且粒径均在100~280 nm,16 d内未发生明显聚集。在pH为7.0时按N/P比为10∶1、15∶1、20∶1制备的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物在20 d内粒径在150～450 nm分布,且未发生明显聚集,较为稳定。结论实验研究设计了一种新型siRNA载体LHRH-MPG△NLS,当N/P大于10∶1时其可将siRNA完全包裹;pH为7.0时N/P为10∶1、15∶1、20∶1时该载体与siRNA均可形成稳定的纳米级复合物,其中N/P为15∶1和20∶1的复合物粒径稳定性优于N/P为10∶1的复合物;在pH 7.0～8.5的溶液中形成的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物均较稳定,没有明显差异。     

TAT-LHRH修饰的壳聚糖/DNA纳米粒的细胞内吞途径

目的 探索对肝癌细胞HepG2具有较高转染效率和靶向性的TAT-LHRH修饰的壳聚糖/DNA纳米粒的内吞途径.方法 采用复凝集法,将荧光标记的质粒DNA与壳聚糖或TAT-LHRH修饰的壳聚糖混合制备壳聚糖/DNA纳米粒(CDN)和TAT-LHRH修饰的壳聚糖/DNA纳米粒(TLCDN).观察3种内吞途径抑制剂Chlor...     

四氢嘧啶类衍生物ZL-5015抗内毒素作用的实验研究

目的:探讨1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二乙酯(ZL-5015)对内毒素攻击小鼠的保护作用及机制。方法:腹腔注射脂多糖(70 mg/kg)制备小鼠内毒素中毒死亡模型和内毒素血症模型。脂多糖(10mg/L)刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症相关细胞因子作为体外炎症模型。ELISA法检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。Real-time PCR检测细胞因子mRNA的表达水平。结果:ZL-5015(100和200 mg/kg)预防性灌胃给药能小幅提高内毒素中毒小鼠的存活率和存活时间,在中毒早期能降低内毒素血症小鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平,提高IL-10的水平。体外实验表明,ZL-5015(10、20和40μmol/L)能抑制内毒素刺激的腹腔巨噬细胞IL-1β和TNF-α蛋白及mRNA的表达,促进IL-10蛋白及mRNA的表达。结论:四氢嘧啶类化合物ZL-5015能提高内毒素中毒小鼠的存活率和存活时间,但作用较弱,其作用机制可能与抑制促炎细胞因子IL-1β和TNF-α、促进抑炎细胞因子IL-10的表达有关。     

阿托伐他汀通过下调NLRP1炎性体表达抑制IL-1β和IL-18的释放

 目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎性体在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬细胞白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)分泌中的作用。方法:用10 μg/L脂多糖诱导THP-1巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18,以不同浓度阿托伐他汀(1、10和20 μmol/L)孵育细胞24 h,或以10 μmol/L阿托伐他汀处理细胞不同时间(12、24和48 h),或转染NLRP1 siRNA以沉默细胞内NLRP1的表达。采用RT-PCR检测细胞内NLRP1炎性体mRNA的表达,Western blot检测细胞内NLRP1炎性体蛋白的表达,ELISA检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。结果:阿托伐他汀可抑制THP-1巨噬细胞NLRP1炎性体mRNA和蛋白的表达,且这种效应呈浓度和时间依赖性。转染NLRP1 siRNA后,THP-1巨噬细胞NLRP1的蛋白表达明显下降,且阿托伐他汀对IL-1β和IL-18分泌的抑制作用明显增强。结论:阿托伐他汀通过抑制NLRP1炎性体表达减少巨噬细胞IL-1β和IL-18的释放,发挥抗炎作用,进而延缓动脉粥样硬化进展。     

组蛋白H2A去泛素化酶MYSM1抑制骨髓来源树突状细胞的抗原提呈功能及炎性细胞因子的分泌

目的研究组蛋白H2A去泛素化酶Myb样SWIRM和MPN结构域1(MYSM1)对骨髓来源树突状细胞(BMDC)吞噬、抗原提呈、炎性细胞因子mRNA水平的影响。方法分离小鼠的骨髓细胞,在体外联合粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导骨髓细胞分化为DC,利用小干涉RNA(siRNA)下调MYSM1的表达,采用免疫荧光微球实验检测BMDC的吞噬功能、流式细胞术检测BMDC的抗原提呈功能、实时定量PCR检测BMDC的IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达变化,探讨MYSM1下调后DC在固有免疫应答中的作用。结果下调MYSM1的表达后,BMDC的吞噬功能无显著变化,抗原提呈功能增强,IL-6、TNF-α的表达增强。结论 MYSM1在固有免疫应答中可以抑制BMDC的抗原提呈功能及炎性细胞因子分泌能力。     

降低蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化促进巨噬细胞M1型分化

目的研究蛋白磷酸酶2A催化亚基C(PP2Ac)去甲基化在巨噬细胞M1型分化中的作用。方法 THP-1细胞经佛波酯(PMA)诱导分化为M0型巨噬细胞,再用脂多糖(LPS)、γ干扰素(IFN-γ)刺激48 h分化为M1型巨噬细胞;处理组和溶剂对照组在M1型巨噬细胞模型上,分别加入0. 5μmol/L ABL127和二甲基亚砜(DMSO)培养48 h。倒置显微镜观察细胞形态学变化,实时荧光定量PCR检测M1型巨噬细胞分化标志物环加氧酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和C-X-C趋化因子配体10(CXCL10)的mRNA水平,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能,Western blot法检测PP2Ac去甲基化水平。结果 M0型巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞,细胞伸出伪足逐渐呈梭形,分化标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL10的mRNA水平明显升高,吞噬功能增强,PP2Ac去甲基化表达下降;处理组加入0. 5μmol/L ABL127,与溶剂对照组相比,PP2Ac去甲基化水平明显降低,梭形细胞增多,分化标志物COX-2、TNF-α、IL-6和CXCL10明显增高,吞噬功能增强。结论降低PP2Ac去甲基化能促进M1型巨噬细胞分化,并增强巨噬细胞促炎性细胞因子表达和吞噬功能。     

游离脂肪酸受体4在腹腔与肺泡巨噬细胞的差异性表达及其与细胞因子表达的相关性分析

目的观察小鼠腹腔和肺巨噬细胞游离脂肪酸受体4(FFAR4)的表达情况并分析与细胞因子水平的相关性。方法采用流式细胞术分选成年BALB/c小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞,应用实时定量PCR检测细胞的FFAR4和白细胞介素1(IL-1)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平,并采用一元线性回归法对FFAR4与细胞因子的相关性进行分析。结果肺泡巨噬细胞的FFAR4 mRNA水平显著高于腹腔巨噬细胞。IL-1和TNF-α的mRNA水平在肺泡巨噬细胞也显著高于腹腔巨噬细胞,IL-10和IL-6的mRNA水平在肺泡巨噬细胞显著低于腹腔巨噬细胞。腹腔FFAR4 mRNA水平与IL-10、IL-6、TNF-α的mRNA水平正相关,与IL-1 mRNA水平负相关。肺巨噬细胞的FFAR4 mRNA水平与IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA水平正相关,与IL-10 mRNA水平负相关。结论 BALB/c小鼠腹腔和肺巨噬细胞的FFAR4 mRNA水平不同,且与细胞因子的水平具有一定的相关性。     

壳聚糖及其修饰物载基因纳米粒子对人初始CD4+T细胞分化的影响

目的 考察壳聚糖及烷基化修饰壳聚糖载基因纳米粒子对人初始CD4+T细胞是否有促分化作用.方法 将壳聚糖或烷基化修饰壳聚糖与去除内毒素的质粒DNA按N/P比为4∶1的比例通过静电作用制备载基因纳米粒子,然后将纳米粒子与人初始CD4+T细胞共孵育,于12、24、48 h以后分别取上清,离心,检测上清中细胞因子IL-4和IF...     

IL-1及TNF促进胸腺细胞的增殖反应

活化的单核/巨噬细胞系能产生两种细胞因子,白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF),二者均有多种生物学作用。最近已经证明,IL-1及TNF 能够促进人成     

白细胞介素-1受体拮抗剂研究进展

白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)是近期新发现的一种细胞因子,能特异性地与白细胞介素-1(IL-1)受体结合而无任何激动剂作用.体内外多种组织和细胞包括单核巨噬细胞,角质细胞等都可以产生IL-1ra,IL-1ra能直接拮抗IL-1的多种生物效应,进一步确证了IL-1在关节炎、结肠炎、休克、白血病等疾病中的地位,对于研究IL-1的病理生理作用和寻找新的用于临床的细胞因子药物具有重要的理论及实践意义.     

小鼠卵黄囊内皮细胞的体外培养及其细胞因子表达的检测

目的:分离纯化小鼠卵黄囊内皮细胞 (YS-EC), 并检测其细胞因子的表达。方法:显微分离小鼠卵黄囊, 经酶消化得到卵黄囊细胞, 卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到小鼠YS-EC, 酵母碎片吞噬实验检测YS-EC的吞噬功能, 免疫组化方法检测YS-EC vWF的表达, 应用Atlas cDNA Expression Array对卵黄囊内皮细胞表达的细胞因子进行检测。结果:经体外培养纯化的小鼠卵黄囊内皮细胞大小形态均一, 为圆形或卵圆形贴壁细胞, 具有克隆形成能力, 在传代培养过程中可形成血管条索样结构, 具有吞噬功能, 表达vWF, 符合内皮细胞的生物学特征。小鼠卵黄囊内皮细胞中有转化生长因子β2 (TGF-β2)、干扰素γ(IFN-γ)、胎肝激酶配基(FL)、骨形态发生蛋白-4 (BMP-4)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、骨形态发生蛋白-2A (BMP-2A)、fms样酪氨酸激酶2(FLT2)、内皮素2(endothelin 2)、胸腺素β10 (thymosin β10)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素13(IL-13)、小分子可诱导性化学因子A5(SCYA5)和酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)等细胞因子mRNA的表达。结论:体外培养纯化的小鼠卵黄囊内皮细胞符合内皮细胞的生物学特征, 有TGF-β2、IFN-γ、FL、BMP-4、MIP-1β、BMP-2A、FLT2、Endothelin 2、Thymosin β10、IL-6、IL-9、IL-13、SCYA5和ACBP等细胞因子mRNA的表达。     

叶酸修饰的聚乙烯亚胺聚合物载PD-L1 siRNA体外靶向胃癌细胞的研究

目的:构建高效的siRNA纳米载体靶向SGC-7901胃癌细胞,并下调胃癌表达的程序性死亡配体1(PD-L1)。方法:检测叶酸(FA)-PEG-SS-PEI-SPION纳米载体与siRNA复合后的粒径、电位等表征;体外实验检验siRNA的结合能力、复合物细胞毒性、细胞摄入能力及转染效率;磁共振(MR)成像检测示踪能力;检验胃癌细胞PD-L1下调效应及共培养T细胞的细胞因子水平。结果:N/P比值为10时,FA-PEG-SS-PEI-SPION完全复合siRNA,形成电位为(9.14±0.80)m V、粒径为(116.7±2.5)nm的多聚复合物。靶向组的转染率为(95.06±0.44)%,与非靶向组的(93.87±1.05)%相当;平均荧光强度为1 892.67±81.51,高于非靶向组的1 324.33±186.58(P0.05)。普鲁士蓝染色和激光共聚焦显微镜成像证实了复合物的细胞摄入。体外MR成像验证了聚合物的MR造影成像能力。靶向组PD-L1的mRNA最低相对表达量为9.07%±0.79%,Western blot显示PD-L1的表达显著降低。共培养实验显示IFN-γ和TNF-α的分泌水平增加,IL-10的分泌水平降低(P0.05)。结论:本研究构建了FA-PEG-SS-PEI-SPION纳米载体,并证明了其体外靶向细胞及载siRNA下调PD-L1表达的能力和MR示踪的能力,是一种高效和安全的靶向治疗纳米载体。     

经内毒素诱导人巨噬细胞系THP1产生的不同于白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α的因子在体内具有刺激多形核白细胞浸润的作用

作者曾报道经内毒素(LPS)刺激的兔巨噬细胞(Mφ)可产生一种不同于白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的因子,它具有刺激多形核白细胞浸润的活性(PRA)。本文则进一步探讨人Mφ有否类似的功能,并与Mφ分泌的其他因子如IL-1、TNF-α和白细胞介素-6(IL-6)等作了比较。首先将人Mφ系THP-1以10ng/ml 佛波     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971 经TLR2 / NF-κB 诱导巨噬细胞分泌细胞因子

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp0971 诱导巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制。方法:以Tp Nichols 株基因组为模板,PCR 扩增Tp0971 基因并构建重组质粒pET28a(+) / Tp0971,随后将其转化至表达宿主菌E.coli Rosseta 中,IPTG 诱导表达,Ni-NTA 亲和层析柱纯化重组蛋白。经去除Tp0971 重组蛋白中的内毒素后,将其刺激巨噬细胞,ELISA 检测细胞因子IL-8、IL-1β和IL-6 的分泌水平。并采用Toll 样受体2(TLR2)中和抗体或TLR2 siRNA,以及核转录因子资B(NF-κB)抑制剂PDTC 处理细胞,观察TLR2 和NF-κB 在介导细胞因子分泌中的作用。结果:成功构建pET28a(+) /Tp0791 原核表达载体,并表达出一相对分子量为29 kD 的重组蛋白。ELISA 结果显示,0.5 ~ 10 g/ ml Tp0791 能以剂量依赖性方式诱导巨噬细胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA 沉默TLR2 表达,或用TLR2 中和抗体封闭后,IL-8、IL-1β和IL-6 分泌明显减少。此外,Tp0791 也能增加细胞核中NF-κB p65 的表达水平,采用NF-κB 抑制剂PDTC 处理后,细胞因子分泌水平也显著降低。结论:Tp0971 经TLR2/ NF-κB 可诱导巨噬细胞分泌细胞因子。     

巨噬细胞纳米尺度生化表征研究获进展

正据刘智斌2021年3月28日[J Mater Chem B,2021,9(12):2909-2917.]报道,中国科学院上海硅酸盐研究所与复旦大学等研究人员合作,利用先进原子力显微术原位表征了白细胞介素13(IL-13)和内毒素(LPS)诱导剂对巨噬细胞的影响,在纳米尺度上阐明了M1/M2型巨噬细胞内部细胞因子和分泌蛋白的差异。巨噬细胞是免疫系统的主要效应细胞,分布于各组织器官,并参与多种生物过程,在机体发育及内环境平衡中发挥重要作用。     

白细胞介素10的生物学性质

白细胞介素10(IL-10)是近年发现的由多种免疫细胞产生并有多种生物学功能的细胞因子.它是巨噬细胞功能的有力抑制剂,但却又对B淋巴细胞发挥多种刺激作用,它还通过影响巨噬细胞功能而抑制T_H1细胞功能.IL-10的生物学性质提示了它在临床上的广泛应用前景.     

白细胞介素10的免疫调节作用及临床应用

白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)是最初在小鼠Th2细胞分泌物中发现的一种独特的细胞因子,因其能抑制Th1细胞细胞因子的合成而引起了国内外学者的广泛关注。随着医学和分子生物学技术的发展,近年来科学家们研究发现IL-10由活化的免疫细胞产生,尤其是单核巨噬细胞和T细胞亚     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971经TLR2/NF-κB诱导巨噬细胞分泌细胞因子北大核心CSCD

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白Tp0971诱导巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制。方法:以Tp Nichols株基因组为模板,PCR扩增Tp0971基因并构建重组质粒p ET28a(+)/Tp0971,随后将其转化至表达宿主菌E-.coli Rosseta中,IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白。经去除Tp0971重组蛋白中的内毒素后,将其刺激巨噬细胞,ELISA检测细胞因子IL-8、IL-1β和IL-6的分泌水平。并采用Toll样受体2(TLR2)中和抗体或TLR2 siRNA,以及核转录因子κB(NF-κB)抑制剂PDTC处理细胞,观察TLR2和NF-κB在介导细胞因子分泌中的作用。结果:成功构建p ET28a(+)/Tp0791原核表达载体,并表达出一相对分子量为29 k D的重组蛋白。ELISA结果显示,0.5~10μg/ml Tp0791能以剂量依赖性方式诱导巨噬细胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA沉默TLR2表达,或用TLR2中和抗体封闭后,IL-8、IL-1β和IL-6分泌明显减少。此外,Tp0791也能增加细胞核中NF-κB p65的表达水平,采用NF-κB抑制剂PDTC处理后,细胞因子分泌水平也显著降低。结论:Tp0971经TLR2/NF-κB可诱导巨噬细胞分泌细胞因子。     

低剂量纳曲酮对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用及机理研究

目的:探讨纳曲酮(Naltrexone,NTX)对小鼠腹膜巨噬细胞表型,分泌细胞因子及吞噬功能的影响。方法:本实验利用新型四唑化合物比色法测得NTX 对RAW264郾7 细胞作用的最佳剂量;再将培养的腹膜巨噬细胞分为3 组,RPMI1640 空白对照组、脂多糖(LPS)阳性对照组和NTX 处理组,采用流式细胞术检测CD206、CD64 的阳性表达率及对葡聚糖的吞噬能力;ELISA 法检测白介素10(IL鄄10)、白介素6(IL-6)、白介素1茁(IL-1)、肿瘤坏死因子 (TNF )的分泌表达。结果:10-11 mol/ L 剂量可显著促进RAW264-7 细胞的增殖;NTX(10-11 mol/ L)处理可明显提高腹膜巨噬细胞表面CD64 的阳性表达,减少CD206 的表达;提高对葡聚糖的吞噬能力;TNF、IL-6、IL1的表达显著增加,IL-10 的表达无明显差异。结论:低剂量纳曲酮可改变巨噬细胞表型及功能,起免疫调节作用。     

三七总皂甙对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生炎性细胞因子的影响

目的研究三七总皂甙(PNS)对脂多糖(LPS)诱导的佐剂性关节炎(AA)大鼠腹腔巨噬细胞产生炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1及IL-6的影响。方法大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂诱发大鼠佐剂性关节炎模型,采用放射免疫法检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1及IL-6。结果体外给药PNS 0.8、0.4及0.2 mg/m l作用24 h,可不同程度的抑制LPS诱导的佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α(P<0.01,P<0.01,P<0.05)及IL-1(均P<0.05)。同时体外给药PNS 0.8 mg/m l可抑制产生IL-6(P<0.05),而PNS 0.4 mg/m l及0.2 mg/m l不能抑制IL-6的产生(均P>0.05)。结论PNS可能通过抑制佐剂性关节炎大鼠巨噬细胞释放炎性细胞因子TNF-α、IL-1及IL-6发挥治疗作用。