藻酸盐凝胶三维培养条件下体外定向诱导骨髓间充质干细胞成软骨

目的 探讨转化生长因子β1 （TGF-β1）,软骨源性形态发生蛋白1（CDMP1）在三维条件下诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的相互作用。 方法 无菌条件下,常规消毒12-20周流产胚胎,无菌术取出股骨。用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化人胚骨髓间充质干细胞,体外培养传代。采用特定的诱导培养使骨髓间充质干细胞向软骨分化,按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为A组CDMP1+TGF-β1（300ng/mlCDMP1、10ng/mlTGF-β1）;B组10ng/mlTGF-β1;C组300ng/mlCDMP1;D组对照组不添加任何生长因子。先进行单层细胞培养10天,再置于藻酸盐凝胶中继续培养11天,然后进行蛋白多糖含量的测定、Ⅱ型胶原的检测。 结果 第21天后,各组细胞培养的个数均有显著性差异,即A组>B组>C组>D组;21天后各组的藻酸盐支架蛋白多糖含量检测结果即A组>B组>C组>D组（P<0.05）。 结论 骨髓间充质干细胞在三维条件下,CDMP1和TGF-β1联合作用有明显的促进骨髓间充质干细胞成软骨的作用。     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

摘要 背景：最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性。 目的：验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况。 方法：贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况。培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量。 结果与结论：发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞。骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养。结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 关键词：胶原蛋白;羟基磷灰石;骨组织工程;骨髓间充质干细胞;支架 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.014     

骨髓间充质干细胞在软骨缺损修复中的应用

学术背景：骨髓间充质干细胞由于其易于获取,并可以在体外短期内大量扩增,是目前最有希望应用于软骨组织工程的干细胞。 目的：对骨髓间充质干细胞在软骨缺损修复中的应用状况进行综述。 检索策略： 由该论文的研究人员应用计算机检索1982-10/2006-12 Pubmed数据库与骨髓间充质干细胞修复软骨缺损相关文献，检索词“Marrow; Mesenchymal stem cells；cartilage defect”，限定语言种类为English, 同时检索1982-10/2006-12 中国科技成果数据库检索词“骨髓；间充质干细胞；软骨缺损”，并限定文章语言种类为中文。共检索到126篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①综述类及实验类文章；②中文核心期刊收录文献。排除标准：重复性研究。 文献评价：文献的来源主要来自Pubmed数据库及中国科技成果数据库。文献类型为综述类及实验研究。 资料综合：骨髓间充质干细胞在体内具有分化产生软骨的能力已被证明,而在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程,目前调控机制仍不明确。动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的骨和软骨缺损。虽然近年来对骨髓间充质干细胞及其在软骨组织工程方面的研究已取得较大进展,但对骨髓间充质干细胞分化各阶段细胞标志物、骨髓间充质干细胞的增殖、分化的控制及基因转染技术及临床应用的评估结果都有待进一步研究。 结论：动物实验表明,骨髓间充质干细胞能够修复具有临床意义的骨和软骨缺损，虽然近年来对骨髓间充质干细胞及其在软骨组织工程方面的研究已取得较大进展,但对骨髓间充质干细胞的基础和临床研究中仍存在诸多问题需要解决。     

纳米晶羟基磷灰石胶原复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损

背景：临床上对大范围骨缺损还没有很有效的治疗手段,而纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料与天然骨骼的结构类似,具有较好的生物相容性,可能为修复骨缺损提供新的途径。目的：观察纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合骨髓间充质干细胞在修复骨缺损中的作用。方法：分离培养人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养;通过大体观察、组织学分析及电镜观察了解成骨情况,进一步临床应用于修复骨缺损。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增,复合细胞的材料植入骨缺损处后,X射线摄片动态观察可见骨缺损处连接良好。说明骨髓间充质干细胞具有成骨细胞作用,纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种很好的构建组织工程骨的支架材料。关键词：骨髓间充质干细胞;羟基磷灰石;纳米材料;组织工程;骨     

生物蛋白胶复合骨髓间充质干细胞修复兔多层软组织缺损

背景：符合软组织生理结构的生物蛋白胶适合作为修复软组织缺损的载体材料。 目的：观察生物蛋白胶复合骨髓间充质干细胞修复软组织缺损的可行性。 方法：在新西兰大白兔大腿处造成深达肌肉层,直径大于3 cm的软组织缺损。将24只新西兰大白兔随机分为3组,实验组将同种异体来源的骨髓间充质干细胞复合生物蛋白胶注射到软组织缺损处,对照组将生物蛋白胶注射到软组织缺损处,模型组造模后不注射。 结果与结论：术后14,21 d创面收缩率,实验组>对照组>模型组(P < 0.01);愈合时间,实验组<对照组<模型组(P < 0.01)。结果显示以生物蛋白胶为载体复合骨髓间充质干细胞能快速的修复多层软组织缺损。     

骨髓间充质干细胞移植修复肾损伤

背景：研究发现外源性骨髓间充质干细胞能够定居于肾脏并且分化为肾脏细胞，参与损伤肾组织的修复，但对其修复作用途径尚无公认。 目的：探讨外源性骨髓间充质干细胞移植对肾损伤的可能治疗作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验，于2007-03/09在南昌大学泌尿外科研究所完成。 材料：清洁级SD大鼠56只。雄鼠8只用于制备骨髓间充质干细胞，雌鼠48只随机分为细胞移植组、模型对照组、假手术组，16只/组。荧光染料DAPI为Biotium Inc产品，蓖麻血凝素为Vector Laboratories产品，BrdU为Sigma产品。 方法：以密度梯度离心法分离鼠骨髓间充质干细胞，加入DAPI进行标记，调整细胞数为1.5×1010 L-1。细胞移植组、模型对照组建立缺血再灌注肾损伤模型，假手术组开腹后不予结扎肾血管。缺血45 min后，细胞移植组经下腔静脉注入用DAPI标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL，模型对照组、假手术组输入1 mL无菌生理盐水。移植后各组每天腹腔注射BrdU，其后留取血标本和肾组织。 主要观察指标：荧光显微镜及免疫组织化学染色观察移植细胞在肾组织中的分布，采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素鉴定移植细胞的分化，以免疫组化方法检测Brdu反映肾组织细胞的增殖状况，检测血清肌苷、尿素氮水平。 结果：移植后第3天可见少量DAPI阳性细胞，第4天DAPI阳性细胞数明显增加（P < 0.05），且多数DAPI标记细胞能结合蓖麻血凝素，DAPI阳性细胞主要分布于肾脏外髓质肾小管中，肾皮质和内髓质阳性细胞很少，而肾小球内则未见DAPI阳性细胞。假手术组肾组织细胞增殖非常弱，移植后第4天Brdu阳性细胞数明显低于模型对照组（P < 0.05）；移植后第2，3，4天细胞移植组Brdu阳性细胞均明显多于模型对照组（P < 0.05），其分布类似于DAPI阳性细胞。与模型对照组比较，细胞移植组大鼠血清尿素氮水平移植后第1，2天明显降低（P < 0.05）；细胞移植组大鼠血清肌苷水平移植后第1，2，3天均显著降低（P < 0.05）。 结论：移植的外源性骨髓间充质干细胞能够迁移、定居于缺血再灌注损伤后的肾组织中并分化为肾小管上皮细胞；骨髓间充质干细胞移植可促进损伤肾脏本身的细胞增殖再生；对肾损伤后早期肌苷、尿素氮的升高具有一定抑制作用，这种早期对肾功能的保护与其迁移定居到肾脏局部、分化修复损伤的肾小管无关。     

复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆煅烧骨在大鼠下颌骨缺损修复中的

背景：用于修复骨缺损的方法有直接植入、复合细胞植入以及加入生长因子植入。近年来,复合细胞植入和加入生长因子植入的研究受到比较广泛的关注。 目的：观察复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨修复颌骨缺损的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-04在青岛大学医学院附属医院中心实验室及口腔研究室完成。 材料：取成年牛长骨骨骺端,经脱脂、脱蛋白、煅烧处理后制得煅烧骨。将第3代的骨髓间充质干细胞悬液加到煅烧骨上制备煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。将富血小板血浆因子滴加到将要植入的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体上,制得含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。 方法：用牙钻在Wistar大鼠左侧下颌骨下缘备出1.0 cm×0.8 cm大小缺损,将30只大鼠随机分为3组,每组10只。对照组：将煅烧骨直接植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞组：将煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组：将含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。 主要观察指标：观察各组煅烧骨在4,8,12周的成骨情况。 结果：复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组煅烧骨在4,8,12周3个时间点的成骨情况明显优于对照组煅烧骨及复合骨髓间充质干细胞组煅烧骨(P < 0.01),对照组和复合骨髓间充质干细胞组之间的成骨情况差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨可以促进下颌骨缺损修复,增加血管化与骨化。     

生物衍生骨与骨髓间充质干细胞复合修复兔桡骨大段缺损

背景：生物衍生支架材料具备与自身骨相似的结构和微环境,具有较好的应用前景。 目的：探讨生物衍生骨复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞修复兔桡骨的节段性骨缺损的可行性,并与单纯生物衍生骨进行比较。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成。 材料：同种异体骨经脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等方法处理后制备生物衍生骨支架材料,与自体骨髓间充质干细胞复合制备组织工程骨支架材料。 方法：25只健康成年新西兰大白兔双侧桡骨制备中段15 mm的骨缺损,随机取其中20只兔右侧桡骨为实验组植入组织工程骨,左侧为对照组植入单纯生物衍生骨,不做内外固定;另5只兔双侧骨缺损处不植入任何材料作为空白组。 主要观察指标：应用X射线放射学检查及组织学观察比较3组骨缺损修复的能力。 结果：X射线显示随时间延长骨折处骨痂逐渐增多, 实验组8周基本愈合,12周塑形完成;对照组骨痂少,愈合时间推迟;空白组术后12周骨缺损未见骨性修复,最后形成骨不连。术后2,4,8,12周实验组放射学检查评价新骨生成优于对照组 (P < 0.05)。组织学检查显示实验组术后4周时材料开始吸收,8周基本降解吸收被新生骨取代,12周完全修复;对照组明显推迟,新骨生成速度、生成量低于实验组(P < 0.05);空白组各时点均无新骨形成,最后缺损由纤维组织充填。 结论：成骨诱导的间充质干细胞／生物衍生骨复合构建组织工程化骨植入修复兔桡骨缺损能够加速新骨形成,其修复能力明显优于单纯生物衍生骨。     

兔骨髓间充质干细胞复合壳聚糖支架的构建研究

背景：组织工程的研究重点是利用少量的细胞经体外培养、扩增后, 在一定环境下附着在三维多孔支架上并良好生长为后期的组织器官重建修复做好基础。 目的：对不同浓度兔骨髓间充质干细胞复合至壳聚糖支架用于组织工程再生修复进行评价。 方法：取50万,脱乙酰度为95％ 的壳聚糖粉末通过冷冻干燥法制备壳聚糖支架,取1*103,1*104,1*105,1*106浓度细胞复合至壳聚糖支架后1.3.5.7.9天以光镜,扫描电镜,MTT法观察骨髓间充质干细胞的生长与分裂增值情况。 结果与结论： 1. 壳聚糖海绵状多孔支架为5mm*5mm*3mm,孔径190 - 380μm平均孔径290μm,孔相通性较好,空隙率为（84.00?.62）%。 2．细胞/支架共培养72h后各浓度细胞组均可渗入壳聚糖支架多孔结构内粘附生长。1*104,1*105,1*106浓度细胞组在支架上成蔟生长,部分细胞与支架融合。 3.1*104,1*105浓度细胞组更利于骨髓间充质干细胞在壳聚糖支架的黏附生长,用于组织再生修复。     

大鼠骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑损伤

目的了解大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）经鼠尾静脉移植后在脑内的表达情况及对大鼠脑创伤后神经运动功能的影响。方法将溴脱氧尿苷（BrdU）标记培养的BMSCs分别在大鼠脑创伤后第1天（实验组1，n=6）、第3天（实验组2，n=10）、第7天（实验组3，，F7）经大鼠尾静脉注射移植，另取6只脑创伤大鼠（实验组4）在伤后第3天经尾静脉移植BrdU标记的全骨髓，尾静脉注射仅．MEM脑创伤大鼠作为对照组（n=6）。应用免疫组化染色，了解移植细胞在脑内的表达情况。脑创伤后第1、3、7、14天评价移植对大鼠神经运动功能的影响。结果脑创伤后14d时神经运动功能评分分别为实验组1：31．83±1．60，实验组2：31．10±1．79，实验组3：28，43±1．72，实验组4：28．67±1．37，对照组：26．00±1．00．各组间差异有显著性（P=0．000）。在移植各组的创伤侧脑组织，可见BrdU染色阳性细胞，并以脉络丛、脑室周围、血管周围分布较多。对实验组2进行免疫组化双染色，未发现BrdU＋神经元特异性烯醇化酶（NSE1、BrdU＋胶质纤维酸蛋白（GFAP）双染色细胞。结论大鼠BMSCs经鼠尾静脉移植．在一定时期内能改善大鼠脑创伤后神经运动功能；脑内可以发现移植细胞存活．但移植细胞是否转化为神经元仍然需要进一步的实验证实。     

自体骨髓基质干细胞及可注射藻酸钙凝胶联合Mosaicplasty技术修复山羊膝关节股骨头大面积缺损**★

背景：目前修复软骨缺损的方法都存在修复组织数量不足，生物力学性能不佳，整合不良及供区并发症等缺陷。对于大面积的骨软骨复合缺损单独应用一种方法尚显不足。 目的：观察组织工程方法复合Mosaicplasty技术用于修复大面积骨软骨缺损的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2009-01/09在青岛大学医学院中心实验室完成。 材料：体外培养并扩增健康成年雄性山羊的骨髓基质干细胞，收集约3×107细胞，加入1 mL藻酸钠溶液重悬形成骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶材料。 方法：12只山羊用于制备膝关节股骨髁大面积骨软骨缺损模型，骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组使用自制Mosaicplasty 器械，植入直径2 mm骨软骨柱镶嵌充填缺损，以自体骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶填充残余缺损和部分供区。Mosaicplasty组单纯用Mosaicplasty修复骨软骨缺损。对照组单纯制造缺损不修复。 主要观察指标：①大体观察：术后4，8，16周分别切开关节观察修复效果。②组织学检查：术后16周取修复组织标本，行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色光镜下观察。③电镜观察：取16周修复组织行透射电镜检查。 结果：术后16周时骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组移植物固定牢固，关节面平滑，移植物间界限消失，新生软骨组织类似于正常软骨，4~16周修复效果逐渐改善，优于其他各组。光镜观察细胞-凝胶新生软骨组织与移植软骨结合紧密，新生软骨细胞排列规整，细胞外基质分布均一。对照组无明显修复。透射电镜观察发现修复新生组织中细胞形态类似软骨细胞，细胞存在于排列紧密的纤维网格中，基质丰富。 结论：使用自体骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶材料复合Mosaicplasty技术可促进骨软骨整合，改善其修复效果。 关键词：Mosaicplasty；骨髓基质干细胞；藻酸钙凝胶；组织工程；软骨；缺损 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.010     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景：以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度。基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破。 目的：进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复。 方法：从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中。实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞。术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况。 结果与结论：体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生。透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨。透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组。组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组。提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损

背景：作者前期试验已成功制备了天然可生物降解的无细胞神经移植物并证明其可促进周围神经再生。 目的：无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经并观察其修复大鼠坐骨神经缺损促进运动功能恢复的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-06/2009-02在辽宁医学院附属第一医院医学组织工程实验室完成。 材料：180~200 g成年健康雄性Wistar大鼠，用于制备无细胞神经移植物，100~120 g成年健康雄性Wistar大鼠，用于制备骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养构建组织工程人工神经。 方法：180~200 g成年健康雄性SD大鼠60只构建坐骨神经15 mm缺损模型，随机分成3组，每组20只。①实验组采用组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损。②空白对照组采用组织工程神经支架桥接大鼠坐骨神经缺损。③自体神经对照组采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损。 主要观察指标：术后12周通过大体观察、电生理检测、组织学和小腿三头肌湿质量等方法分析评价运动功能恢复情况。 结果：①术后12周，实验组大鼠手术侧足趾可以分开，并且可以支撑着地；实验组大鼠再生神经传导速度与自体神经对照组相比，差异无显著性意义。②术后12周，实验组组织化学染色可见腓肠肌内有呈AchE阳性的运动终板整齐地排列于腓肠肌的中上部形成终板带，经结合镀银染色后可见再生的神经束及发出的分支与运动终板相连。③实验组与自体神经对照组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义。 结论：无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞桥接大鼠坐骨神经缺损具有促进其运动功能恢复的作用。     

筋膜包裹的骨髓间充质干细胞/聚己内酯复合体血管化组织工程骨修复比格犬骨缺损

背景：骨组织工程技术的材料/细胞复合物已能在肌肉、皮下等异位组织内成骨,或是在小型哺乳动物的骨缺损处修复成骨,但这与临床的实际仍有较大差距,骨组织工程技术能否修复大型哺乳动物大范围的骨缺损,以及如何促进组织工程骨的体内再血管化进程还不明确。 目的：观察应用比格犬带血管蒂深筋膜瓣及组织工程骨在体内的成骨情况。 方法：分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞以自然沉淀法进行组织构建,接种于聚己内酯材料上,与支架材料复合。在比格犬左足胫骨中段制作骨-骨膜缺损模型,植入以筋膜包裹的骨髓间充质干细胞/聚己内酯复合体作为实验组;右足制作胫骨中段骨-骨膜缺损模型后,植入骨髓间充质干细胞/聚己内酯复合体;另取2只犬制作骨-骨膜缺损模型不植入任何材料作为空白对照。术后进行大体、X射线片、组织学、磁共振灌注成像观察骨模具上成骨细胞生长与血管化情况。 结果与结论：空白对照组无新骨生成,无血管长入,最后缺损由纤维瘢痕组织填充;对照组8~16周骨缺损逐渐被骨样组织填充,可见较多的骨痂,骨痂向移植物长入,断端连接不完全,髓腔硬化。实验组成骨过程及速度明显优于对照组,术后6周骨痂量较多,术后8周支架材料已完全降解,术后12周骨缺损完全修复,可见大量松质骨形成,新骨髓腔较通畅,骨皮质连续较牢靠,所形成的血管在数量、孔径和发布上均明显优于对照组。提示组织工程骨有较强、较快修复大动物大段负重骨缺损的能力,而带蒂的筋膜瓣则通过促进其再血管化而使其这种能力得到更好的发挥。     

不同接种密度骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复大鼠桡骨缺损

背景：在构建种子细胞与载体材料的复合体时,种子细胞的接种密度是影响复合体成骨能力的一个重要因素,目前关于种子细胞的接种密度认识尚不统一。 目的：构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,观察构建复合体骨髓间充质干细胞的最适接种密度。 方法：体外单层培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,以不同的细胞密度将骨髓间充质干细胞接种到异种骨基质明胶上,构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,通过扫描电子显微镜观察细胞在骨基质明胶中的黏附生长情况。制备SD大鼠双侧桡骨骨干5 mm节段性骨缺损模型。随机分成4组,采用骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复骨缺损,所用的接种细胞密度分别为1×108 L-1、5×108 L-1、1×109 L-1、5×109 L-1。各组于第2,4,8,12周取材,通过大体观察大鼠的术肢活动情况,X射线放射学、组织学,免疫组织化学等检测方法,对骨缺损的修复情况进行评价。 结果与结论：4种细胞密度与骨基质明胶复合培养24 h,骨髓间充质干细胞在骨基质明胶上的黏附率随着细胞接种密度的增高而增高,当密度为1×109 L-1时,黏附率最高为(76.00±2.94)%,继续增加细胞密度其黏附率反呈下降趋势。复合培养7 d,扫描电子显微镜观察结果显示,材料上均有细胞黏附生长。X射线放射学评分显示,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P < 0.01);第4,8,12周1×109 L-1组与5×109 L-1组差异无显著性意义 (P > 0.05),均高于其余两组(P < 0.01)。组织学评分结果表明,同一组别8,12周评分均高于2周评分 (P < 0.01)。结果提示,在构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体时,骨髓间充质干细胞接种密度维持在1×109 L-1最佳。     

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损☆

背景：众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用，并参与调节骨改建及修复的一系列过程。 目的：观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨，提高骨缺损修复质量。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。 材料：体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞，并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。 方法：BalB/C裸鼠15只制备颅骨8 mm缺损模型，随机数字表法分为3组，每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位，空白对照组仅造模，不进行任何干预。造模后4周处死动物，取出颅骨进行组织学观察。 主要观察指标：①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清，用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3，6 d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。 结果：①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测，胰岛素样生长因子1 基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3 d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入；6 d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维；而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应，胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密；而空载体细胞组植入物可推动；空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密，骨折缺损区有新骨及血管形成；空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少；空白对照组缺损未见修复。 结论：胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。     

基因修饰骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松性下颌骨缺损**☆

背景：近年来基因修饰干细胞与支架材料复合形成组织工程化骨为修复骨缺损提供了骨组织重建的全新思路。 目的：实验拟观察转染人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架材料修复骨质疏松症下颌骨缺损的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-06/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成。 材料：6月龄未孕雌性SD大鼠24只，SPF级，体质量250~300 g，构建绝经后骨质疏松症动物模型。含人骨形态发生蛋白2基因的pcDNA3.1-hBMP-2重组质粒由解放军第三军医大学提供；支架材料珊瑚羟基磷灰石由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。 方法：24只SD模型大鼠随机数字表法分为实验组和对照组，每组12只。3个月后分别取其骨髓间充质干细胞培养。实验组骨髓间充质干细胞通过脂质体Lipogen介导转染pcDNA3.1-hBMP-2质粒，对照组细胞未作处理。3 d 后将每只大鼠骨髓间充质干细胞与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合，再分别对应地植入取材动物的自体下颌骨极限性骨缺损区。 主要观察指标：术后第4，8周组织切片行免疫组织化学染色，观察新骨形成情况。术后8周进行成骨量的半定量检测。 结果：24只SD模型大鼠均进入结果分析。①术后4周实验组在珊瑚羟基磷灰石材料边缘有新生骨质形成，8周时见相互连接的层板状成熟骨基质形成，对照组4周时只在材料边缘有少量骨基质形成，8周时新生骨质数量上明显少于实验组，且材料边缘及中央处有脂肪样结构形成。②对照组术后8周新生骨所占面积百分比为（0.046±0.004）%，实验组为（0.233± 0.015）%，各组成骨量差异具有显著性意义（P < 0.01）。 结论：人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石支架形成的组织工程化骨修复骨质疏松症下颌骨的成骨量较无基因修饰明显增加。     

藻酸钠微球介导髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响

背景：椎间盘退行性变的理想治疗方法是利用组织工程技术修复退行性变的椎间盘，而修复所需的髓核细胞来源十分有限。 目的：观察在藻酸盐微球的介导下，髓核细胞与骨髓间充质干细胞非接触共培养时，髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，实验于2007-10/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和中心实验室进行。 材料：4月龄健康新西兰大耳白兔5只，取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养，利用传代法分离纯化。 方法：①将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集，并与适量的藻酸钠溶液混合，形成109 L-1的单细胞悬液，将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至35 g/L的CaCl2溶液中，形成海藻酸钙凝胶珠。②将海藻酸钠凝胶微球与髓核细胞共培养。在7 d和15 d时，分组溶解海藻酸钙凝胶珠，收集骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：利用免疫组化技术、RT-PCR技术和Western blot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达，用以判断髓核细胞对骨髓间充质干细胞在非接触条件下的诱导作用。 结果：在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性，RT-PCR和Western blot结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达，且诱导15 d组的目的条带明显亮于诱导7 d组的目的条带。 结论: 在藻酸盐微球的介导下，体外非接触共同培养时髓核细胞能够实现对骨髓间充质干细胞的诱导作用。     

辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖分化的影响**

背景：辛伐他汀对正常大鼠骨代谢及骨髓基质干细胞增殖分化影响的报道目前不多。 目的：观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响,及其在此过程中Smad1,2,7 mRNA表达水平的变化。 方法：16只6周龄雌性SD大鼠按体质量随机均分成2组,对照组每天灌胃蒸馏水,实验组灌胃辛伐他汀20 mg/(kg•d),持续9周。于最后一次灌胃的第2天取左侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取右侧股骨和胫骨骨髓基质细胞向成骨方向诱导培养,并采用CCK-8法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16,28天检测碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色阳性细胞比;细胞培养第21天,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测Smad1,2,7的mRNA表达。 结果与结论：辛伐他汀体内给药干预9周后,大鼠骨量和骨密度无显著变化,体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、细胞增殖能力、细胞外基质矿化能力、碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色阳性细胞比两组间差异均无显著性意义 (P > 0.05)。结果显示20 mg/(kg•d)辛伐他汀体内给药9周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化及Smad1,2,7的表达无显著作用。