人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究

目的探讨人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法经1%TritonX100、0.01%胰酶0.02%EDTA、DNaseI及RNaseI处理制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性;人骨髓基质干细胞体外分离、培养、扩增后种植在去细胞瓣叶表面,观察细胞生长情况。结果猪主动脉瓣叶去细胞后获得完整无细胞的纤维网状支架,瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率差异无统计学意义(P>0.05);体外培养的人骨髓基质干细胞(MSCs)在去细胞瓣叶表面形成一层基本连续的细胞层。结论去除细胞成分的猪主动脉瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

骨髓诱导分化内皮细胞构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

骨髓基质干细胞（BMSCs）在特定培养条件下能够诱导分化为内皮细胞,是构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）较有前景的种子细胞来源.我们研究探讨应用BMSCs诱导分化的内皮细胞和猪去细胞瓣膜支架体外构建TEHV的可行性.     

去细胞猪主动脉瓣支架及兔骨髓干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉瓣支架(ace llu larized porc ine aortic va lve scaffo ld,APAV S)与兔骨髓干细胞(bone m arrow strom a l ce lls,BM SC s)体外构建组织工程瓣膜的可行性。方法采用去垢剂+核酸酶消化法处理,去除猪主动脉瓣细胞成分,并作去细胞前后的形态学检查和生物力学测定;在去细胞支架上种植兔BM SC s,行形态学检查和免疫组织化学染色观察。结果光学显微镜、扫描及透射电子显微镜下可见猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全被去除,获得完整无细胞的纤维网状支架。瓣叶去细胞前后的断裂强度(642±102g/mm2vs.636±127g/mm2)和断裂伸长率(62.2%±18.1%vs.54.4%±16.0%)差别无统计学意义(P>0.05)。种植的兔BM SC s在APAV S表面形成一层连续的细胞层。免疫组织化学检查α-平滑肌动蛋白抗体(+),CD 31(-)。结论种植兔BM SC s于APAV S上,可在体外构建组织工程心脏瓣膜。     

组织工程心脏瓣膜构建的研究

机械瓣、生物瓣是目前临床常用的二种瓣膜替换物 ,终身抗凝、瓣膜衰败为其最大不足[1] 。我们利用人主动脉肌成纤维细胞 (ＭＦ)及多聚乙醇酸 (ＰＧＡ )降解材料 ,构建组织工程心脏瓣膜(ＴＥＨＶ) ,并从构建ＴＥＨＶ方法学角度探讨其实施过程中的注意事项。一、材料与方法1.人主动脉ＭＦ细胞的分离与扩增 :取移植供心升主动脉 ,磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ )冲洗 ,常温Ⅰ型胶原酶 (75～ 80ｍｇ/Ｌ ,美国Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ生化公司 )消化3 0ｍｉｎ ,细胞刷分离内皮细胞。裁剪主动脉壁 ,使之成为 2～ 3ｍｍ碎片 ,置于底面积 75ｃｍ2 培养瓶 (Ｆａ…     

自体内皮细胞化组织工程同种心脏瓣膜的初步构建

同种心脏瓣膜以优良的生理特性及组织结构特点广泛应用于瓣膜替换手术及婴幼儿复杂先心病矫治术中，取得良好的临床疗效，但远期易出现钙化、毁损，因而再次移植率较高。2002年3月至2003年12月本研究应用组织工程学方法改良同种心脏瓣膜，构建新型的自体内皮细胞化的组织工程同种心脏瓣膜，以减轻移植后免疫排斥反应，延长瓣膜使用寿命。     

应用胶原支架构建组织工程心脏瓣膜的初步研究

目的 探讨应用胶原支架构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法 行兔皮下包埋实验。分别于4、6、8、12周观察材料的生物相容性和降解率。将犬主动脉壁间质细胞和主动脉内皮细胞种植于胶原膜上，进而将此瓣叶植入犬腹主动脉内3个月，观察材料吸收和瓣叶结构的变化。结果 胶原膜呈网孔状结构，孔径107μm。皮下包埋实验显示，材料生物相容性好，完全降解时间为12周。体内实验显示，材料于12周末被间质细胞合成的细胞外基质所取代，瓣叶表面有内皮细胞覆盖。结论 以胶原膜为支架构建组织工程心脏瓣膜是可行的，但材料在强度和组织相容性方面尚需改进。     

应用猪主动脉去细胞瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜

目的　探讨应用猪去细胞瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。　方法　采用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法制备猪主动脉瓣去细胞瓣膜支架 (实验组 ) ,用去内皮细胞主动脉瓣作对照 (对照组 ) ,并对两组含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、力学性能和组织相容性进行测定。培养犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞 ,将其种植于实验组去细胞支架上 ,观察细胞生长情况 ,并测定内皮细胞合成前列环素的功能。　结果　实验组瓣膜细胞成分完全从瓣膜中去除 ,与对照组新鲜瓣膜相比 ,含水量增高 (P<0 .0 5 ) ,可溶性蛋白含量减少 (P<0 .0 5 ) ,热皱缩温度和抗张强度无明显变化。实验组瓣膜组织相容性试验显示 ,材料组织相容性好 ,体内降解时间为 10周 ;犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞在瓣膜表面生长良好 ,内皮细胞具有合成分泌前列环素的功能。　结论　采用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法制备猪主动脉瓣去细胞瓣膜支架 ,在去除细胞和可溶性蛋白质的同时保持了瓣叶的基本结构和力学性能 ;以其为支架体外构建组织工程心脏瓣膜的细胞不仅能在材料表面生长 ,还能合成、分泌血管活性物质 ,是具有生理功能的组织工程心脏瓣膜。     

组织工程心脏瓣膜研究进展

临床治疗心脏瓣膜病常用瓣膜替代物各有缺点 :机械瓣需终身抗凝 ,易致出血、栓塞及感染 ;异种生物瓣易退行性变 ,10～ 15年需再次手术 ;同种生物瓣易钙化 ,来源短缺。而非生长性是以上瓣膜共有缺陷。组织工程心脏瓣膜(TEHV)按照组织工程学方法 ,利用可降解材料构建瓣膜支架 ,种植的自体细胞在支架上生长并产生细胞外基质(ECM ) ,逐渐形成活的瓣膜组织。它有良好的组织相容性 ,可避免血栓栓塞、钙化等问题 ,有自我修复能力 ,随机体生长 ,因此被认为是较理想的新型瓣膜替代物。自 1995年Shinoka等[1] 首次将单叶TEHV羊肺动脉瓣自体移植 ,…     

促进组织工程心脏瓣膜细胞黏附力的初步研究

目的探讨纤维连接蛋白(Fn)增强种子细胞与组织工程心脏瓣膜(TEHV)黏附力的可行性,为组织工程心脏瓣膜的构建提供良好的细胞基础。方法取6个规格相同的有P4HB[聚β羟基丁酯]构建的心脏瓣膜,气体消毒后分别置入12孔板中,每2个为1组,前两组分别被Fn及多聚赖氨酸(poly-lysine)包被,第3组空白对照。24 h后分别种植骨髓基质干细胞0．8×10~5个,24h后在瓣膜背面再分别种植0．25×10~5个。2周后分别行MTT检测及扫描电镜检测；取不同数量的MSC,行MTT检测,制作不同细胞个数与MTT吸收光度的曲线。结果经Fn包被的MTT吸光度A值(0．128 96±0．004 896)及poly-lysine包被的MTT吸光度A值(0．12033±0．03991)均明显高于对照组(0．11254±0．006556),P＜0．05,Fn组与poly-lysine组比较有统计学意义,前者高于后者。结论Fn能有效的促进细胞在生物可降解的组织工程心脏瓣膜的黏附及增殖,是发展组织工程心脏瓣膜的一种优良的促细胞黏附剂。     

兔骨髓间质干细胞用于构建组织工程软骨组织的初步报告

目的 采用组织工程方法,以培养后的兔骨髓间质干细胞（MSC）制成人工软骨培养物,经体内外培养后发育出成活的软骨组织。方法 抽取兔人经密度梯度离心得到单个核细胞,再经体外分离、培养获得兔骨髓MSC。向MSC培养液内加入地塞米松、转化生长因子－β1（TGF－β1）和维生素C进行软骨起源诱导培养3周,部分细胞开始转变为圆形并分泌基质。将诱导后的细胞与牛Ⅰ型胶原及人纤维蛋白按一定的比例混合,制成软骨样的培养物并分别做体内外培养。结果 体外培养2周后,培养物内大部分细胞已萎缩消失。但剩余的少量细胞成活,形成类似的软骨陷窝并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。体内移植培养3周后,培养物已发育成颗粒状成熟的软骨组织。结论 骨髓间质干细胞可用于组织工程软骨组织的构建,是一种非常有前途的人工软骨组织构建中的功能细胞。     

A new source for cardiovascular tissue engineering: human bone marrow stromal cells

Objective: Vascular-derived cells represent an established cell source for tissue engineering of cardiovascular constructs. Previously, cell isolation was performed by harvesting of vascular structures prior to scaffold seeding. Marrow stromal cells (MSC) demonstrate the ability to differentiate into multiple mesenchymal cell lineages and would offer an alternative cell source for tissue engineering involving a less invasive harvesting technique. We studied the feasibility of using MSC as an alternative cell source for cardiovascular tissue engineering. Methods: Human MSC were isolated from bone marrow and expanded in culture. Subsequently MSC were seeded on bioabsorbable polymers and grown in vitro. Cultivated cells and seeded polymers were studied for cell characterization and tissue formation including extracellular matrix production. Applied methods comprised flow cytometry, histology, immunohistochemistry, transmission (TEM) and scanning electron microscopy (SEM), and biochemical assays. Results: Isolated MSC demonstrated fibroblast-like morphology. Phenotype analysis revealed positive signals for alpha-smooth muscle actin and vimentin. Histology and SEM of seeded polymers showed layered tissue formation. TEM demonstrated formation of extracellular matrix with deposition of collagen fibrils. Matrix protein analysis showed production of collagen I and III. In comparison to vascular-derived cell constructs quantitative analysis demonstrated comparable amounts of extracellular matrix proteins in the tissue engineered constructs. Conclusions: Isolated MSC demonstrated myofibroblast-like characteristics. Tissue formation on bioabsorbable scaffolds was feasible with extracellular matrix production comparable to vascular-cell derived tissue engineered constructs. It appears that MSC represent a promising cell source for cardiovascular tissue engineering.     

内皮祖细胞和去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣膜的研究

目的将内皮祖细胞(EPCs)诱导分化为内皮细胞后种植在去细胞猪主动脉瓣膜(APV)上,以期为组织工程瓣膜(TEHV)的研制提供一个新的思路。方法采用去垢剂联合胰蛋白酶法去除猪主动脉瓣膜细胞。采用密度梯度离心法从羊骨髓中分离出EPCs,并诱导分化后,免疫组织化学染色鉴定。将诱导分化得到内皮细胞种植到APV上。采用光镜和电镜检测猪主动脉瓣膜的去细胞效果。对内皮细胞在APV上的生长效果进行观察。结果猪主动脉瓣内的细胞完全去除。EPCs经定向诱导后,具有表达CD-31,CD-34,von Willebrand因子等内皮细胞特征。诱导分化后的EPCs可以在APV表面黏附生长,并且表达CD-31和yon Willebrand因子。结论EPCs可以定向诱导分化为内皮细胞并可以在APV上种植生长。     

骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞作为组织工程瓣种子细胞的对比

目的 诱导分化骨髓间充质干细胞(BMSC)及内皮祖细胞(EPC),进行BMSC及EPC作为组织工程瓣膜(TEHV)种子细胞的对比.方法 分离扩增BMSC及EPC,分别定向诱导分化为内皮细胞,比较两种细胞在形态学、增殖能力、黏附力以及细胞冻存和复苏率方面的特点与区别.结果 光镜下,两种细胞均为贴壁生长细胞,BMSC的形态为梭形或多角型,EPC的形态为圆形及不规则形状,第2代诱导的BMSCs、EPCs的倍增时间分别为34 h和35 h,诱导后的BMSC冻存和复苏率以及黏附力与EPC之间差异无统计学意义;电镜示两种细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上.免疫组织化学结果显示两种细胞种植后的瓣膜上均有间质细胞生长.结论 BMSC和EPC诱导后可分化为内皮细胞,两者之间差异无统计学意义,都是合适的TEHV种子细胞.     

骨髓基质干细胞与珊瑚复合物体内回植时间的研究

目的　探索骨髓基质干细胞和珊瑚复合物的体内回植时间。方法　骨髓基质干细胞经成骨诱导分化后与珊瑚复合 ,体外培养 1、3、5、7d时行相差显镜镜、扫描电镜观察 ,并行裸鼠皮下回植。结果　 3d时 ,骨髓基质干细胞与珊瑚达到较好的复合状态 ,皮下回植有新骨形成。结论骨髓基质干细胞与珊瑚复合后体外培养 3d时就可以体内回植。     

含锌煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的　探讨含锌煅烧牛松质骨和单纯煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞 (MSCs)构建的组织工程骨在体内的成骨能力。方法诱导培养骨髓基质细胞 ,将其分别接种至含锌煅烧牛松质骨及单纯煅烧牛松质骨 ,植入肌肉内 ,分别于术后 4、8周处死实验动物 5只 ,行组织学观察和新生骨面积测定。结果　术后不同时间组织学观察含锌组新生骨明显多于单纯组 ,新生骨面积测定值含锌组分别为 (17619.14 5± 44 5 9.816)、(2 5 2 3 8.5 3 9± 1995 .164 ) μm2 ,单纯组分别为(80 5 6.5 3 7± 5 67.60 3 )、(10 787.95 7± 92 5 .5 0 9) μm2 。含锌组明显大于单纯组 (P <0 .0 5 )。结论　含锌煅烧骨作为骨组织工程的支架材料优于单纯煅烧骨 ,是一种理想的生物活性支架材料。     

纤维蛋白用做骨组织工程载体并修复骨缺损

[目的]研究将纤维蛋白用做骨组织工程的载体材料。[方法]将兔骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外大量培养扩增后，与同种兔纤维蛋白制成凝胶复合物，对复合物进行成骨性诱导培养，观察细胞增殖与分化情况。进而将含自体BMSCs的复合物填充于兔桡骨节段性缺损区，观察其对骨缺损的修复效果。[结果]BMSCs与纤维蛋白复合物在体外培养条件下可保持完整形状、细胞大量增殖，并发生成骨性分化和分泌钙盐。植入复合物的骨缺损区修复效果显著优于植入单纯纤维蛋白。[结论]纤维蛋白可为BMSCs提供良好的增殖与分化环境，二者复合物可用于组织工程法修复骨缺损。     

Tissue engineering of heart valves in vivo using bone marrow-derived cells

In this study, we tissue-engineered heart valves in vivo using autologous bone marrow-derived cells (BMCs). Canine BMCs were differentiated into endothelial cell (EC)-like cells and myofibroblast (MF)-like cells. Decellularized porcine pulmonary valves were seeded with BMCs and implanted to abdominal aorta and pulmonary valve of bone marrow donor dogs. Histological examination of the explants identified the regeneration of valvular structures expressing CD31 and smooth muscle alpha-actin, indicating the presence of EC-like and MF-like cells in the grafts at 3 and 1 week, respectively, after implantation. Fluorescent microscopic examinations identified the presence of fluorescently labeled cells in the explants, indicating that the implanted BMCs survived and participated in the heart valve reconstitution. This study reports, for the first time, on tissue engineering of heart valve in vivo using BMCs.     

脱细胞牛心包种植人血管混合细胞构建组织工程心脏瓣膜

目的 探讨在脱细胞牛心包上种植人血管混合细胞构建组织工程心脏瓣膜的方法与效果.方法 将体外培养的人血管混合细胞种植在脱细胞牛心包材料上,观察种子细胞形态学和免疫组织化学变化和牛心包超微结构变化,并测定内皮细胞分泌t-PA和PAI-1的活性.结果 种子细胞全层覆盖脱细胞牛心包表面,并浸润至组织内部生长;牛心包表面为扁平、片状、分层的细胞覆盖,细胞表面有少量绒毛和纤细的纤维结构.免疫组化显示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白、成纤细胞Fibronectin相关抗原呈阳性表达;种子细胞能分泌纤溶活性物质t-PA和PAI-1.结论 人血管混合细胞种植后附着满意,与脱细胞牛心包生物相容性好,生长状况好,并具有内皮功能.     

Bone marrow stem cells for urologic tissue engineering

OBJECTIVES: Experiments in rats and dogs have demonstrated the potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for urinary tract tissue engineering. However, the small graft size in rats and a failure to identify the MSCs in engineered tissues made it difficult to assess the true potential of these cells. Our goals were to characterize MSCs from pigs, determine their ability to differentiate into smooth muscle cells (SMCs) and use them in an autologous augmentation cystoplasty. METHODS: MSCs were isolated from pigs and analyzed for common markers of MSCs by flow cytometry. SMC differentiation was determined by immunoblotting. MSCs were isolated, genetically labeled, expanded in vitro, seeded onto small intestinal submucosa (SIS) and used for autologous bladder augmentation. RESULTS: Porcine MSCs are morphologically and immunophenotypically similar to human MSCs. Culturing MSCs at low density enhances proliferation rates. MSCs consistently differentiate into mature SMCs in vitro when maintained at confluence. Labeled MSCs grew on SIS over one week in vitro and survived a 2-week implantation as an autologous bladder augment in vivo. Some label-positive cells with SMC morphology were detected, but most SMCs were negative. Notably, many cells with a urothelial morphology stained positively. CONCLUSIONS: Porcine MSCs have similar properties to MSCs from other species and consistently undergo differentiation into mature SMC in vitro under specific culture conditions. Labeled MSCs within SIS may assist tissue regeneration in augmentation cystoplasty but may not significantly incorporate into smooth muscle bundles.