番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析

目的获取番茄果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因番茄中果实特异性表达做准备。方法培养中蔬5号(Zhongshu No.5)番茄幼苗, 采集叶片,用Omega公司的植物基因组提取试剂盒提取番茄基因组DNA;设计引物,从基因组中通过PCR扩增获得番茄果实特异性E81.1和E82.2启动子基因;克隆进pGEM-T载体,酶切鉴定;送上海基康公司测序;序列分析。结果从番茄基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段;构建重组pGEM-T-E81.1和pGEM-T-E82.2载体,经酶切证实具有与目标片段长度相符的插入片段;测序结果分析显示:番茄果实特异性E8启动子序列高度保守,所获得的Zhongshu No.5 E82.2启动子DNA序列与Deikman报道的Cherry种的E82.2启动子同源性为99%, 登陆GenBank, ID号为AF515784。结论成功获得Zhongshu No.5番茄果实特异性E81.1、E82.2启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的工作基础。     

伯氏疟原虫抗原基因高效植物表达载体的构建

目的构建果实特异启动子驱动的含伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白PbMSP4/5(Plasmodium berghei merozoitesurface protein4/5)基因的植物表达载体,并进一步提高抗原基因的表达量和免疫原性,为研制有效的转基因植物疟疾疫苗打下基础。方法分别以提取的番茄和伯氏疟原虫Anka株的基因组DNA为模板,扩增番茄果实特异表达启动子E8的核心序列(约1.11Kb)及PbMSP4/5基因(704bp),并通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOE)PCR将二者拼接,拼接后的序列为EM,并合成霍乱毒素B亚基基因CTB,共同构建重组质粒pCAMBIA1302-EM-CTB,电击法转化根癌农杆菌GV3103。结果重组质粒经酶切鉴定证明已成功转化。结论实验成功构建了以番茄果实特异启动子驱动PbMSP4/5基因、以CTB为黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体。     

果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建

目的 构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区(sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础。方法提取番茄基因DNA,利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因,双酶切质粒。PROP及PROSC,分别与目的基因连接,构建重组植物表达载体。结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中。结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含sbr基因的植物表达载体。     

转基因植物表达质粒中SBR基因的序列分析

目的 对转基因植物表达质粒pROP1中含SBR基因P1片段（184－1946bp）进行序列测定和分析。方法 从E.coliDH5a中提取质粒p ROP1,et PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪检测P1片段的序列,并与GenBank上的变形链球菌表面蛋白基因序列比较,检测其准确性。结果 测定了P1片段5＇端616个碱基序列和3＇端466个碱基序列,其准确性达98％。结论 PCR扩增的P1片段5＇端和3＇端的DNA序列与变形链球菌表面蛋白pac基因唾液粘附区相一致,为转基因番茄防龋疫苗的研究提供了基础资料。     

马铃薯块茎特异性启动子克隆及其驱动的hIL12表达载体构建

目的 克隆马铃薯块茎特异性的高效启动子Ppatatin并构建其驱动的人白细胞介素-12（hIL12）植物表达载体.方法 提取马铃薯基因组DNA作为模板,根据Genebank数据库信息设计Ppatatin序列特异性引物,通过PCR扩增获得Ppatatin片段,并进行测序鉴定;利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析;通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Ppatatin驱动的hIL12表达载体.结果 成功从马铃薯基因组中扩增得到了1019 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Ppatatin驱动的hIL12植物表达载体.结论 获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础.     

番茄转基因检测方法的实验研究

目的：探讨转基因番茄的检测方法。方法：采用PCR扩增法，对通常转基因植物共有的35s启动子序列进行检测，确定其是否转基因；结果与结论：采用改进的CTAB方法提取DNA纯度较高，质量较好，反应体系3扩增效果最佳，62～64％为最佳退火温度。     

改进的亚硫酸氢钠测序法检测HepG2 RASSF1A基因CpG岛甲基化状态

目的 改进亚硫酸氢钠测序法，并检验改进后方法在甲基化检测中的可行性。方法 提取人肝癌细胞株HepG2基因组DNA，亚硫酸氢钠化学修饰，针对修饰后Ras相关家族1A基因（RASSF1A）启动子序列设计特异引物并结合沉降PCR扩增，T-A载体克隆、测序。结果 HepG2细胞RASSF1A基因启动子CpG岛的16个CpG位点均被甲基化。结论 改进后亚硫酸氢钠测序法能明显减少非特异性扩增，提高PCR效率，更适于基因甲基化状态的检测。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

人端粒酶启动子(hTERTp)真核表达载体的构建

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）的启动子，构建真核表达载体pEGFP—hTERT。方法以人类基因组DNA为模板，应用PCR方法扩增hTERT上游序列长约1135bp的启动子片段，克隆入绿色荧光蛋白GFP的基因上游，测序鉴定。结果DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，片段长度为1135bp。结论人端粒酶启动子的真核表达载体pEGFP—hTERT构建成功，为hTERTp调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗奠定了基础。     

乙型肝炎表面抗原基因植物高效表达载体的构建

目的构建果实特异性启动子驱动的含乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达量,为研制有效的转基因植物防乙肝病毒疫苗打下基础。方法将番茄果实特异性启动子基因2A12和E8 ,分别插入到pBPFΩ7构建中间载体pB2A12和pBE8 ;酶切YEP-HBs载体中的HBsAg小蛋白,并插入到pB2A12和pBE8 ,得到载体pB2A12-HBs和pBE8-HBs ;将其中“p35S 2A12 Ω HBsAg-s Tnos”片段和“p35S E8 Ω HBsAg-s Tnos”片段分别亚克隆到pCAMBIA1301 ,得到植物表达载体pCAM2A12-HBs和pCAME8-HBs。测序鉴定pCAM2A12-HBs、pCAME8-HBs中的启动子和HBsAg片段。最后将pCAM2A12-HBs、pCAME8-HBs转化根癌农杆菌EHA105。结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pCAM2A12-HBs、pCAME8-HBs的测序结果正确。结论本实验成功构建了番茄果实特异性启动子和Ca MV35S组成型启动子共同驱动HBsAg基因的植物表达载体。     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究

目的 扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4(desmoglein 4,Dsg4)胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列,为寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris, PV)发病机制的研究提供依据.方法 根据GenBank中的Dsg4序列(登录号为AY177664)分析,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人正常皮肤组织中抽提RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链反应(PCR)扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因;应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4 DNA连接酶作用下相连接,转化E.coli DH5α感受态细菌,用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子DNA序列测定鉴定;重组融合蛋白经ELISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应.结果 RT-PCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350 bp的4条条带;质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在GenBank登录的Dsg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致,4个Dsg4胞外区域cDNA读码框架正确;Dsg4 EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应,而不与正常对照组血清反应.结论 Dsg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用.     

黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性

目的;观察黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）启动子在小鼠体内的表达活性。方法：利用ＰＣＲ技术扩增２．２ｋｂ的ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ启动子,分子克隆技术构建ＭＩＡ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ａｃＺ）载体,显微注射法将纯化的２．２ｌａｃＺ ＤＮＡ注入来自Ｂ６ＳＪＬ杂交小鼠受精卵的原以制备转基因小鼠。提取幼鼠尾ＤＮＡ,用ｌａｃＺ特异性引物筛选阳性转基因小鼠。结果：８只首建小鼠以体基因组整合有２．２ｌａ     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

细胞周期素D2启动子曲古菌素A效应区域的研究

目的 研究在曲古菌素A(trichostatin A,TSA)处理条件下细胞周期素D2的调控机制.方法 细胞周期素D2的mRNA水平通过RT-PCR方法 检测.细胞周期素D2的启动子片段以A549细胞基因组DNA为模板,通过高保真PCR扩增获得,并克隆到pGL3-BASIC载体中;并以此为基础通过高保真PCR扩增出不同...     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。