FSH和IGF-1对大鼠卵巢细胞微囊化前后的影响

目的：观察微囊化卵巢细胞的形态变化及卵泡刺激素（FSH）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对其增殖功能的影响,探讨微囊化卵巢细胞作为内源性雌激素来源的可行性。方法：分离21 d龄雌性SD大鼠卵巢细胞,将培养至第一代的卵巢细胞微囊化包裹后接种于96孔板,加入含不同浓度的FSH和IGF-1（浓度分别为0、6.3、12.5、25、50、100 ng/mL）的无血清培养液;另将正常培养的卵巢细胞培养24 h后换无血清培养液进行相同的处理,培养44 h后,加入WST-1试剂,继续孵育4 h。全自动酶标仪测定光密度。结果：卵巢细胞在微囊内呈圆形均匀分布,48 h后形态无显著变化。FSH对培养的卵巢细胞和微囊化的卵巢细胞的增殖刺激作用均呈剂量依赖性,卵巢细胞的增殖刺激作用在FSH 50 ng/mL时,达到最高峰（P〈0.05）;对微囊化卵巢细胞的刺激作用在FSH 100 ng/mL时,细胞的增殖活性达到最高峰（P〈0.05）;IGF-1对卵巢细胞的刺激增殖作用在低剂量组不显著（6.3、12.5、25 ng/mL,P〉0.05）,在高剂量组（50、100ng/mL）对卵巢细胞的刺激作用与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。IGF-1对微囊化卵巢细胞的刺激增殖作用呈剂量依赖性（P〈0.05）,在IGF-1 50 ng/mL和100 ng/mL组,微囊化卵巢细胞的OD值与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：卵巢细胞在微囊化后,可以在微囊内存活并保持其生物学活性,并且可以对外源性的FSH和IGF-1的刺激产生反应。     

微囊化新生猪胰岛细胞体外培养胰岛素分泌能力的研究

本文利用胶原酶消化法制备新生猪胰岛细胞，用微囊包膜技术，将胰岛细胞包裹后体外培养。比较微囊化及本微囊化新生猪胰岛细胞胰岛素分泌能力和胰岛素刺激释放试验。果表明：微囊化胰岛与未微囊化胰岛一样具有良好的生物活性。海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠生物微胶囊及其制备技术对胰岛细胞活性和分泌功能无明显影响。微囊包膜新生猪胰岛可能将为临床异种移植提供良好的供体来源。     

微囊化牛视网膜色素上皮细胞体外BDNF及GDNF分泌特性的研究

目的检测体外培养的牛视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE）脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）及胶质源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）分泌特点,并观察微囊包裹对细胞存活率及BDNF和GDNF分泌的影响。方法原代培养牛RPE,用高压静电成囊装置制备海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化细胞,台盼兰染色法检测囊内细胞活性,ELISA法检测BDNF及GDNF分泌量。结果原代及传代后RPE上清液中在基础状态下就能够检测到BDNF和GDNF,传代后两者的分泌量较原代无显著差异。微囊化细胞BDNF和GDNF分泌量在1-5 d与未微囊化细胞相比显著降低（P〈0.01）,而6-8 d两组无显著差异。囊内活细胞数及BDNF和GDNF分泌量在体外培养的第14天至第21天趋于稳定。结论RPE基础状态下就能够分泌少量BDNF和GDNF,且不受传代及微囊包裹的影响。体外培养21 d后仍检测到囊内细胞的存活及BDNF和GDNF的分泌。牛RPE是一种具有一定前景的帕金森病细胞移植的供体。     

微囊化血管内皮细胞生长因子基因修饰NIH3T3细胞的制备及体外培养

目的:制备微囊化血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰NIH3T3细胞,并研究微囊化技术对VEGF基因修饰NIH3T3细胞增殖及其分泌VEGF功能的影响.方法:应用海藻酸钠-氯化钡技术制备微囊化VEGF基因修饰NIH3T3细胞,并与未微囊化VEGF基因修饰NIH3T3细胞对照培养,在倒置相差显微镜下观察微囊及细胞形态,用MTT法和PI染色流式细胞术检测细胞的增殖及活性情况.每48 h收集微囊化及未微囊化基因修饰NIH3T3细胞培养上清,-20℃保存,ELISA法检测培养上清VEGF的含量.结果:微囊形态较圆整,其内细胞生长良好;两组细胞增殖与活性及培养上清中VEGF含量无统计学差异.结论:微囊化并不影响基因修饰细胞的生长代谢功能,与对照组比较,在体外培养时生物学特性无明显差异,为研究微囊化基因修饰细胞体内移植奠定了基础.     

微囊化大鼠胰岛细胞的冷冻保存

目的探讨海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸微囊在胰岛细胞冷冻保存过程中的作用。方法将分离纯化后的大鼠胰岛细胞分为微囊化组和游离组。经冷冻保存1月后在RPMI 1640中培养过夜,分别测定两组的胰岛细胞回收率、胰岛细胞直径并进行胰岛素刺激释放试验。结果微囊组胰岛细胞回收率为98．2％±1．4％,较游离组71．6％±2．9％显著提高 (P<0．05)。在高糖(16．7 mmol／L)刺激下,微囊组胰岛素分泌量较游离组高(22．6±1．8 mU/Lvs 11．7±1．5 mU/L,P<0．05)。在含有茶碱的高糖溶液中,微囊组的刺激指数为游离组的3倍。结论海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸微囊可显著提高胰岛细胞冷冻保存后的回收率,并改善胰岛细胞的功能。     

微囊化卵巢细胞对去卵巢大鼠骨质疏松的影响

目的通过观察去卵巢大鼠微囊化卵巢细胞移植后血清激素及骨代谢相关因子的变化,探讨微囊化卵巢细胞作为防治绝经后妇女骨质疏松方法的可行性。方法将12周龄SD雌性大鼠30只随机分成3组,每组10只:假手术组(SHAM组)、去卵巢组(OVX组)和微囊化卵巢细胞移植组(MOVT组)。OVX组和MOVT组大鼠切除双侧卵巢,SHAM组大鼠不切除卵巢,仅切除与卵巢大小相当的脂肪组织。卵巢切除术10天后SHAM组、OVX组大鼠腹腔注射0.9%NaC l溶液2m l,MOVT组大鼠则腹腔注射微囊化卵巢细胞2m l。术后4周尾静脉采血,分离血清测定E2、FSH、LH及骨代谢相关因子TGF-β、IL-6、IGF-1。结果卵巢切除术后,与SHAM组大鼠比较,OVX组大鼠血清E2的水平显著降低(P<0.01),FSH、LH水平则显著升高(P<0.01);微囊化卵巢细胞移植后,MOVT组大鼠血清E2水平与OVX组比较显著升高(P<0.05);FSH、LH水平均明显降低,LH更加显著(P<0.01)。卵巢切除术后,OVX组大鼠血清TGF-β、IGF-1水平显著下降,IL-6含量则明显升高,与SHAM组比较差异均非常显著(P<0.01);微囊化卵巢细胞移植后,MOVT组大鼠血清TGF-β、IGF-1水平均明显升高,与OVX组大鼠比较分别有非常显著和显著差异(P<0.01、P<0.05),血清IL-6含量降低,与OVX组大鼠比较差异非常显著(P<0.01)。结论微囊化卵巢细胞移植具有预防去卵巢大鼠骨质疏松发生的作用,微囊化卵巢细胞移植作为临床防治绝经后骨质疏松的一种手段具有良好的应用前景。     

微囊的制备及研究进展

药物微囊化技术是指将固态或液态药物包裹成为直径为1～500μm药库型微型胶囊,不同囊材制备的微囊有不同的特性,药物微囊化后,对于药物的一些特性具有改良作用。针对不同的药物选择不同的囊材和制备工艺具有重大意义。微囊质量评价的有效参数包括形态、粒径及其分布,药物含量测定,药物的释放,载药量和有机溶剂残留量。     

大鼠肾上腺皮质细胞微囊移植研究

目的 :将成年大鼠肾上腺皮质细胞分离 ,培养并微囊化后植入肾上腺功能低下大鼠模型体内 ,以探索新的肾上腺移植途径。方法 :成年SD大鼠分成三组 :A组为对照组 ,B组模型植入体外培养并微囊化的肾上腺皮质细胞 ,C组模型植入未经微囊化的肾上腺皮质细胞 ,用放射免疫方法 (RIA)检测移植术后 3 ,9,2 1,42 ,6 3d模型鼠血中皮质醇浓度 ,9周后行组织学检查。结果 :(1)B组大鼠血浆皮质醇最后达 (30 1.33± 88.81)nmol/L ;(2 )植入微囊化肾上腺皮质细胞的模型鼠组织切片 ,未发现排斥反应。结论 :接受微囊化肾上腺皮质细胞移植后肾上腺功能低下大鼠的血清皮质醇水平可接近正常值。     

微囊化转Maspin基因细胞对乳腺癌微血管密度及肺转移影响的实验研究

目的 观察Maspin基因抑制肿瘤血管形成和肺转移的作用及微囊化转基因细胞体内治疗恶性肿瘤的可行性.方法 将乳腺癌细胞Bcap37细胞注射到裸鼠背部皮下,制成荷瘤裸鼠动物模型,再用微囊化转Maspin基因的中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO细胞)进行干预治疗,1个月后,测量移植肿瘤的大小,免疫组化法检测肿瘤组织的血管内皮生长因子(VEGF)表达,并据此计算微血管密度(MVD),同时观察肺转移的情况.结果 干预治疗1个月后,移植肿瘤的MVD明显降低[(26±9)与(60±16),P＜0.05],肺转移率也明显减低(55%与15%,P＜0.05).结论 Maspin可明显抑制肿瘤血管形成和肺转移的发生,微囊化转基因细胞体内治疗恶性肿瘤是可行的.     

人头皮毛乳头细胞的微囊化培养

目的：探讨微囊化人头皮毛乳头细胞体外培养及异体移植的可行性。方法：采用“一步酶消化法”分离、培养人头皮毛乳头细胞。用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹后体外培养，MTT分析细胞活性；并将微囊化的人头皮毛乳头细胞移植于小鼠腹腔，观察微囊的免疫隔离效果。结果：强。在微囊完整、表面无纤维化时，微囊内细胞生存良好。成囊后短期细胞活性较低，但随营养的改善，细胞活性逐渐增结论：微囊化人头皮毛乳头细胞可在体外及异体内培养。     

采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究

目的比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响,寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案。方法将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组,包括冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组。观察各组卵巢组织卵泡形态;冻融后的卵巢组织行体外培养,比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度。结果冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组,差异有统计学意义（P〈0.05）。冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面组,原始卵泡形态正常率分别为（64.57±11.84）%、（78.36±7.62）%、（77.21±6.51）%和（84.70±5.03）%。固相表面组原始卵泡形态正常率明显高于其他玻璃化组（P〈0.05）。体外培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随培养时间逐渐升高。固相表面玻璃化组两种激素平均浓度明显高于其他玻璃化组。培养后卵巢组织中原始卵泡所占比例均较新鲜组下降,生长卵泡比例升高。固相表面玻璃化组培养后生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组。结论固相表面玻璃化冷冻可以保存大部分原始卵泡的正常形态,并能较好地保存其体外生长和性激素分泌功能。该技术简便易行且冷冻效果好,适合人卵巢组织玻璃化冷冻的临床使用。     

温肾中药对原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖的影响

目的观察温肾中药对雌二醇和孕酮所致的原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖的影响。方法采用消化法进行正常人乳腺上皮细胞分离及原代培养。在相差倒置显微镜和透射电镜下对细胞进行形态学鉴定。应用雌二醇和孕酮干预以促使正常人乳腺上皮细胞增殖,给予不同浓度温肾中药及他莫昔芬进行药物干预。采用MTT法检测不同浓度、不同药物干预下乳腺上皮细胞的增殖情况。结果原代培养正常人乳腺上皮细胞经形态学鉴定符合正常人乳腺上皮细胞的形态学特征。浓度均为1×10-5g/L的雌二醇和孕酮混合培养液可以明显促进正常人乳腺上皮细胞增殖。高浓度温肾中药能明显促进原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖,而低浓度温肾中药则可抑制其增殖。他莫昔芬对原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖无明显影响。结论雌二醇和孕酮可以促进正常人乳腺上皮细胞增殖。温肾中药调节正常人乳腺上皮细胞增殖的作用与药物浓度相关。     

雌、孕激素对体外培养种植窗期子宫内膜腺上皮细胞降钙素表达的调节

目的 探讨雌、孕激素对体外培养人类子宫内膜腺上皮细胞降钙素（Ｃｔ）表达的影响及其意义。方法　建立子宫内膜 腺上皮细胞体外培养体系．分别用雌二醇（Ｅ２）、孕酮（Ｐ４）刺激细胞２４ｈ、４８ｈ,其浓度分别为１× １０－７、１×１０－８、１×１０－９ｍｏｌ／Ｌ 和１×１０－６、１×１０－７、１×１０－８ｍｏｌ／Ｌ,利用流式细胞仪对Ｃｔ表达阳性细胞进行检测。结果　性激素影响体外培养的人子宫内膜 上皮细胞Ｃｔ的表达,Ｐ４促进Ｃｔ表达,并呈剂量依赖性,１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ作用２４ｈ,其促进效应最强;而低剂量Ｅ２对Ｃｔ表 达无明显影响,高浓度Ｅ２则抑制其表达。结论　子宫内膜上皮细胞Ｃｔ的表达受性激素调节,在人类胚胎着床过程中起 重要作用。     

人羊膜上皮细胞向卵泡样结构转分化的实验研究

目的研究人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells ,hAECs）在人卵泡液的长时间刺激下能否转分化为卵泡样结构。方法在前期实验结果基础上,体外分离培养hAECs,5%人卵泡液为诱导条件,延长诱导时间至44 d,倒置显微镜观察细胞形态学改变,化学发光免疫技术检测培养基上清液中雌激素（estradiol,E ₂ ）水平的变化,实时荧光定量-聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测雌性生殖细胞特异性基因（GDF9、DAZL、SCP3）表达情况。 结果诱导组（添加有5%卵泡液的培养基）在培养第10天出现卵母细胞样细胞（OLCs）,随着时间延长,OLCs体积增大,周围见透明带样环变,随后减小,部分消失;对照组无上述现象。诱导组DAZL及GDF9的mRNA表达水平较对照组升高（P<0.05）,并且具有两个高峰;诱导组SCP3mRNA表达水平与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。诱导组有E ₂ 生成,其水平随时间先下降后升高再下降;对照组无E ₂ 生成。结论在体外,hAECs具有向卵泡样结构转分化的潜能。     

雌二醇与雷洛昔芬对体外培养成骨细胞生物学功能的影响及护骨素表达的调控

目的 比较雌二醇与雷洛昔芬对体外培养成骨细胞的生物学作用及对护骨素(OPG)表达的影响。方法 在新生SD大鼠头颅骨第二代成骨细胞培养液中加入不同浓度的雷洛昔芬,并设立雌二醇阳性对照及空白血清对照组;分别观察成骨细胞的增殖、分化和矿化功能;半定量RT-PCR测定成骨细胞中OPG基因的表达。结果 体外培养成骨细胞在加入不同剂量的雷洛昔芬后,细胞增殖率(A₅₇₀)、OPG蛋白表达与空白对照组相比均无明显差异(P>0.05);但碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节数明显升高,与空白对照组相比差异显著(P<0.05,P<0.01),且与雷洛昔芬浓度呈量效关系;雌二醇对成骨细胞的A₅₇₀值、ALP活性、矿化结节数量、OPG表达等的影响和对照组相比均有显著差异(P<0.01)。结论 雌二醇对体外成骨细胞生物学功能的影响非常显著,并可上调OPG蛋白表达及表达量;雷洛昔芬对体外成骨细胞分化矿化均有影响,但对增殖影响不显著;对OPG表达也无明显影响。此结果提示雷洛昔芬影响骨代谢可能不通过OPG代谢途径,它对体外成骨细胞的作用机制与雌二醇不完全相同。     

雌二醇与雷洛昔芬对体外培养成骨细胞生物学功能的影响及护骨素表达的调控

OBJECTIVE: To study the effect of raloxifene and estradiol on the biological function and osteoprotegerin expression of osteoblasts in vitro. METHODS: Different doses of raloxifene and estradiol were added into the medium of the second generation osteoblasts from the shull of newborn SD rats. The proliferation, differentiation, mineralization and osteoprotegerin expression of the osteoblasts in different groups were observed. RESULTS: Raloxifene had no significant effects on stimulating the proliferation, the expression of osteoprotegerin and the formation of mineral nodes of the cultured osteoblasts (the trial vs the control, P>0.05). However, raloxifene can significantly improve the alkaline phosphatase activity of the cultured osteoblasts (the trial vs the control, P<0.05). Estradiol significantly increased the proliferation of osteoblasts, and differentiation, mineralization, expression of osteoprotegerin (P<0.01 vs the control). CONCLUSION: The effects of raloxifene and estradiol on the cultured osteoblasts are different, which implied their different mechanisms in inducing osteoporosis.     

雌二醇通过BDNF促进端脑神经细胞增殖与分化

目的：探讨雌二醇（E2）在神经组织中的作用机制，分析E2对神经细胞增殖及神经元分化的影响，以及其是否由脑源性神经营养因子（BDNF）介导。方法离体条件下培养动物端脑神经组织，设置各实验组，分别以 E2、E2受体抑制剂、BDNF、BDNF抗体或以上试剂联合处理，之后进行相关免疫组织化学染色分析不同处理条件下神经细胞的增殖、神经元分化情况；在此基础上通过实时荧光定量PCR检测E2能否调节BDNF基因的表达。结果 E2和BDNF均能促进新生神经细胞的产生，增加Hu＋神经元数目，E2受体抑制剂及BDNF抗体则有相反作用；并且E2的作用效果能被BDNF抗体消减，而E2受体抑制剂不能影响BDNF正常发挥作用；实时荧光定量PCR实验结果显示，E2能显著上调BDNF mRNA的表达，而E2受体抑制剂能抑制BD‐NF mRNA表达。结论体外培养条件下，E2对神经组织内细胞增殖、神经元分化的促进作用可由BDNF介导。     

机械法和胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的比较

目的 探讨胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的优势。方法 取3～4周龄雌性SD大鼠的卵巢,分别采用机械法和胰酶法分离颗粒细胞并进行培养。机械法：于40倍解剖显微镜下用针头刺破卵巢成熟的卵泡,将含有卵巢剩余组织及卵泡液的培养液用200目滤网过滤;胰酶法：用无菌眼科剪将卵巢剪成小于2 mm³的小碎块,然后加入0.25%胰酶,室温消化1 h后,将含有卵巢碎块的消化液用200目滤网过滤。比较这2种分离方法获得的细胞数量、细胞活力,及雌二醇和孕酮的分泌情况。结果 机械法和胰酶法这2种方法分离的原代大鼠卵巢颗粒细胞存活率均>90%。将细胞培养1～9 d,除24 h外,其余各时间点胰酶法分离的细胞增殖率均高于机械法;胰酶法细胞增殖率峰值出现时间早于机械法24 h,并且胰酶法分离的细胞最大增殖率[72 h：（210.09±0.95）%]高于机械法[96 h：（180.50±0.74）%],差异有统计学意义（P<0.05）。胰酶法分离的细胞激素的最大分泌量、每日平均分泌量及分泌总量均高于机械法,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 胰酶法分离的大鼠卵巢颗粒细胞在细胞活力和激素分泌功能方面均优于机械法,值得在卵巢早衰的研究中推广使用。     

子宫内膜异位症细胞雌激素与芳香化酶表达的研究

目的检测芳香化酶与雌激素在子宫内膜异位症(简称内异症)细胞中的表达及其作用。方法建立体外原代培养内异症子宫内膜细胞系13份,异位病灶基质细胞系5份,非内异症内膜细胞系6份。采用化学发光法检测细胞上清液中雌二醇的表达水平,应用蛋白印迹法和RT-PCR的方法观察在原代培养子宫内膜异位症内膜细胞、异位病灶细胞以及对照组内膜细胞中的芳香化酶表达情况,以及生理药物浓度的雌二醇刺激原代培养子宫内膜异位症子宫内膜细胞、异位病灶细胞时芳香化酶的表达。结果统计分析显示三组培养细胞上清液的雌二醇表达无显著差异。内异症子宫内膜与异位基质细胞全部表达芳香化酶,而非内异症子宫内膜细胞很少或极低水平表达(P<0.001)。芳香化酶mRNA的表达在培养内异症子宫内膜低于异位基质细胞,但显著高于非内异症子宫内膜细胞(P<0.001)。雌二醇可以显著增加培养内异症细胞芳香化酶及其转录刺激因子SF-1蛋白与mRNA表达。结论子宫内膜细胞异常表达芳香化酶可以认为是内异症发生、发展的根源之一;雌激素能促进体外培养内异症内膜细胞与异位基质细胞芳香化酶的表达。     

奠基方含药血清对类多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能影响的研究

目的:观察奠基方含药血清对类多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞(GC)体外分泌功能的影响。方法:采用血清药理学方法,以不同类PCOS大鼠含药血清,与体外培养的颗粒细胞共同培养48 h,观察奠基方含药血清对类PCOS卵巢颗粒细胞雌激素(E2)、孕酮(P)分泌量的影响。结果:奠基方含药血清可明显增加颗粒细胞E2的分泌量,降低P的分泌量。结论:奠基方可通过调节颗粒细胞的分泌功能进而改善类PCOS的卵巢功能。