小鼠精原干细胞体外培养的研究

目的建立精原干细胞与Sertoli共培养细胞模型,探讨Sertoli支持精原干细胞扩增的可能机制。方法以7—8 d龄小鼠为材料,Percoll密度梯度离心,并将分离后的生精细胞接种至Sertoli饲养层上,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养15 d的细胞进行苏木精-伊红染色、C-Kit受体检测。结果①增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合。②苏木精-伊红染色显示培养的生殖细胞大小均匀,核大而圆着色深。C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性,背景基质细胞为阴性。这些均符合精原干细胞的生物学特征。结论精原干细胞在未加入细胞因子的Sertoli饲养层中能较长时间生长并分裂增殖。     

GDNF和SCF促进小鼠精原干细胞增殖与分化的研究

目的 探讨小鼠精原干细胞增殖和分化体外控制的可行性.方法 采取7～8日龄雄性小鼠睾丸,分离纯化精原干细胞接种在添加神经营养因子的培养基内进行增殖培养,7 d后更换添加干细胞生长因子的培养基.结果 SSCs接种于Sertoli细胞饲养层上4 d后,出现了增殖现象,可见增殖产生SSCs克隆,AKP染色阳性,β1整合素免疫细胞化学染色阳性,RT-PCR扩增出长度约为120 bp的Oct-4和280 bp的c-kit条带.结论 小鼠精原干细胞在添加50 ng/mL GDNF的培养基内培养7 d后更换添加10 ng/mL SCF的培养基可以实现小鼠SSCs从增殖到分化的转变.     

脂多糖所致小鼠睾丸支持细胞GDNF表达减少对精原干细胞的影响

目的   探讨脂多糖（LPS）处理后的小鼠睾丸支持细胞(SCs)中胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达的变化及该变化对精原干细胞（SSCs）的影响。 方法   取5～6周龄昆明小白鼠睾丸组织,分离纯化并培养SCs,将其分为4组：正常对照组（Con组）,添加LPS处理1d组（1d组）、2d组（2d组）和3d组（3d组）,收集4组培养液作为条件培养液,采用RT-PCR和Western blot检测各组SCs GDNF表达的变化;取5～7d龄昆明小乳鼠睾丸组织,筛选SSCs后分为4组：Con组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,分别用前面的4组培养液培养96h。通过免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中PLZF、oct4、PCNA和c-kit、sohlh2的表达变化,并通过RT-PCR检测SSCs中Gfrα1、c-ret和Bcl6b、Etv5的表达变化。  结果   RT-PCR与Western blot结果显示,SCs GDNF表达按Con、1d、2d、3d组的顺序降低; RT-PCR和免疫荧光染色结果显示,SSCs PLZF、oct4和PCNA的表达按Con、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组顺序降低,而c-kit和sohlh2的表达按Con组、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组顺序升高; SSCs中Gfrα1、c-ret、Bcl6b与Etv5的表达Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组均低于Con组。 结论   LPS处理导致小鼠SCs GDNF表达减少,该变化可使SSCs分化加速而其自我更新受到抑制,其机制可能与Bcl6b和Etv5的表达下调有关。     

FAAH在小鼠精原干细胞中的表达研究

目的:验证脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase,FAAH)在小鼠精原干细胞(spermatogonial stem cell,SSCs)中的表达?方法:构建稳定的小鼠SSCs培养平台,Western blot法检测FAAH在小鼠各组织脏器和SSCs的表达,免疫荧光法检测FAAH在睾丸组织及SSCs中的定位情况?结果:Western blot结果表明FAAH在睾丸组织高表达?免疫荧光显示FAAH定位于小鼠SSCs的细胞膜并且与已知的分选标记神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)家族受体α1(GDNF family receptor alpha-1,GFRα1)共定位?结论:FAAH可作为一个新的SSCs分选富集的表面分子标记,为进一步研究FAAH在精子发生的作用打下基础?     

精原干细胞移植

精原干细胞 (SSCs)是哺乳动物成体睾丸生精上皮内唯一可复制的多潜能二倍体细胞 ,它能在体外分离纯化、培养、冻存及同体或异体移植。 1994年 ,RalphBrinster实验室[1] 首次报道了SSCs移植 ,并证明它在运用于干细胞以及支持细胞 生殖细胞相互关系的研究中是一项技术性的突破。     

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞

目的 探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性.方法 以7～8日龄小鼠睾丸为材料,采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层,应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化,应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性.采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞,观察受精卵的发育状况.结果 三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9%、1.6%、0.35%;流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%;诱导精子样细胞能激活卵母细胞,囊胚发育率20.36%.结论 新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞,并具有激活卵母细胞的能力.     

小鼠精原干细胞生物学特征的研究

目的:探讨培养状态下精原干细胞的生物学特征,为体外鉴定精原干细胞及认识精原干细胞在体内的生物学行为打下实验基础.方法:在预先制备的骨髓基质饲养单层上接种生后6～10天雄性小鼠生精细胞,于IMDM培养基及37℃下培养,倒置显微镜观察细胞增殖行为并对增殖后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化及遗传学检测.结果:培养状态下的精原干细胞增殖经历了短暂增殖期、静止期和分离增生期三个阶段,且增殖细胞呈簇、团状生长,细胞问可见明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条).结论:精原干细胞具有典型的生物学行为和特征,结合行为及生物学特征可对增殖的精原干细胞进行鉴定.     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞(sperm atogon ial stem cells)是一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞,它能向子代传递遗传信息,是男性成体内唯一可复制的双倍体细胞。精原干细胞在医学、生物工程学、遗传、转基因研究等方面有着广阔的应用前景。现将近年来精原干细胞的研究成果综述如下     

葡萄籽提取物原花青素对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡的影响

目的:探讨葡萄籽提取物原花青素对隐睾生精细胞凋亡的影响,为临床治疗某些特发性男性不育症药物的开发研究提供实验依据.方法:将雄性健康SD大鼠40只随机分为隐睾+原花青素(高、中、低剂量)组、隐睾+生理盐水组、假手术组5组,每组8只大鼠,每天定时定量灌胃3次,7天后断颈处死大鼠,双侧睾丸称湿重并取手术侧睾丸HE染色观察组织...     

非人灵长类动物精原干细胞研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是维持精子发生的一类干细胞,由于与人亲缘关系的相近性,使得开展非人灵长类动物SSCs研究具有重要的理论意义和比较医学价值。本文综述了非人灵长类动物SSCs的生物学特性、鉴定方法、冷冻保存、移植及生精细胞缺失模型建立等方面的研究进展。     

造血干细胞辐射损伤和修复的研究Ⅳ.——苯甲酸雌二醇对小鼠造血干细胞辐射损伤和修复的影响

小鼠于照前7天由肌内注射苯甲酸雌二醇,根据骨髓粒系祖细胞(CFU-D),内源性脾结节(CFU-S),以及骨髓细胞分裂指数和染色体畸变率的改变,探讨其对受照射小鼠造血功能的影响。在照射后的早期,不论CFU-D的数量或染色体畸变率,用药与对照组之间均未见有差异,而在照射后的第3、5、9天,给药组CFU-D的产率均比不用药的对照组有明显提高,而且,骨髓细胞分裂指数在照后3～5天亦高于对照组。上述结果提示,苯甲酸雌二醇的辐射防护作用主要不在减轻造血干细胞的辐射损伤,而与促进残存干细胞增殖有关。     

小鼠精原干细胞染色体G带显示及其影响因素研究

目的:探索精原干细胞染色体G带显示技术及其影响因素,为如何鉴定培养状态下干细胞的染色体核型提供实验参考.方法:培养昆明系小白鼠精原干细胞,待细胞生长到15～20天时,吸出克隆细胞团,吹打分散后滴加秋水仙素处理4～6小时.收集细胞悬液,再经低渗处理后滴片染色制成.结果:正常小鼠精原干细胞染色体呈粒状、棒状,核型为20对,40条.结论:小鼠精原干细胞染色体受到细胞所处的分裂时期、低渗处理的效果、滴片时细胞的分散程度及胰酶浓度及消化时间等因素的影响.     

兔精原干细胞培养及生物学特征的初步研究

目的:建立精原干细胞的培养方法并对培养细胞的生物学特征进行研究.方法:用饲养层和无饲养层两种方法培养幼家兔精原干细胞,在倒置相差显微镜下观察培养细胞的生长和形态变化,并对细胞的糖原、脂质及c-kit受体的细胞化学和免疫细胞化学染色结果进行分析.结果:成功的分离并培养幼家兔精原干细胞.在培养细胞中精原干细胞为主体细胞,并可见少量间质细胞.根据精原干细胞体积大小和形态特点,可分为大、小两种类型.PAS染色,精原干细胞胞质呈阳性反应;免疫细胞化学染色显示,体积较小的精原干细胞c-kit受体呈强阳性反应,体积较大的大精原干细胞呈弱阳性反应;间质细胞PAS染色和c-kit受体染色呈阴性反应,而脂质染色呈强阳性反应.精原干细胞培养无论有无饲养层,均能呈集落状生长,但有饲养层的培养,细胞的生长明显优于无饲养层培养.结论:青春期前的睾丸生精小管是精原干细胞最集中、数量最多,且容易获取分离的部位;精原干细胞的成功培养为今后重建完整的生精细胞系的治疗性移植和对这类定向干细胞的发育及分化潜能的研究提供了细胞模型.     

四氧嘧啶所致的糖尿病对大鼠CFU-GM产率的影响

本文观察到四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠CFU-GM 产率降低,胰岛素治疗可使之部分恢复。胰岛素能直接提高扩散盒及体外培养中CFU-GM 产率,其在体外的作用与浓度有一定关系。在一定范围内高葡萄糖浓度可促进体外培养中CFU-GM 产率。     

玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响

目的体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究玻璃粘连蛋白(VN)在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法贴壁分离培养法分离纯化rMSC,观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VN包被的培养板培养,每4d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形,第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构;细胞表达CD44、CD90,而不表达CD34。用以VN包被的培养板培养12d,碱性磷酸酶染色呈阳性,硝酸银染色显示有钙结节形成。结论VN有诱导rMSC向成骨方向分化的作用。     

6-羟基多巴胺对帕金森病大鼠GDNF表达影响的实验研究

目的 :研究 6 -羟基多巴胺 (6 - OHDA)诱发的大鼠帕金森 (PD)模型 GNDF表达。方法 :通过脑内立体定向术注射 6 -羟基多巴胺建立大鼠 PD模型。采用免疫组化的方法观察损伤侧脑胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)表达。结果 :6 - OHDA诱发的 PD鼠 GDNF蛋白表达减低 (P <0 . 0 5 )。结论 :神经营养因子表达减少可能是 6 - OHDA诱发的 PD大鼠发病机制之一     

刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨刺五加注射液对大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）增殖的影响。方法体外培养MSC，用四甲基偶氮唑法检测刺五加注射液促进大鼠MSC增殖的作用；用免疫组化法检测MSC细胞的Brdu标记阳性率。结果4种浓度的药液对MSC的增殖作用与对照组比较有显著性差异（P〈0．05）。结论刺五加注射液有促进MSC增殖的作用。     

脂肪源性干细胞对大鼠坐骨神经功能恢复的影响

目的：：探讨脂肪源性干细胞（ADSCs）对大鼠坐骨神经功能恢复的影响。方法：将第4代ADSCs移植入脱细胞神经移植物（ANA）中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常对照组、培养基组和实验组,培养基组和实验组均建立坐骨神经损伤模型,然后用相应的组织工程神经桥接损伤神经的断端。术后6W和12W采用神经电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅。结果：术后6 W、12W,实验组坐骨神经传导速度和波幅明显高于培养基组（P<0.05）,但低于正常对照组（P<0.01）;并且,实验组术后12W时的神经传导速度和波幅明显高于术后6W（P<0.05）。结论：ADSCs可增加坐骨神经传导速度和波幅,促进坐骨神经功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的:寻找良好的软骨组织工程种子细胞.方法:抽取兔骨髓液,分离纯化骨髓液中的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并传代扩增.将第3代BMSCs分成实验组和对照组,实验组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液加入转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和地塞米松联合诱导,对照组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液自然分化.在诱导4、7、14 d后,分别用甲苯胺蓝染色检测细胞蛋白多糖的表达,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测细胞Ⅱ型胶原的表达并计算阳性率.结果:BMSCs取材方便,体外培养生长稳定,细胞活性好.实验组BMSCs向软骨细胞分化,细胞甲苯胺蓝染色异染,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性率(72.51±9.49)%与对照组(2.15±1.88)%相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:BMSCs是软骨组织工程良好的种子细胞.