人脐血和脐带源MSCs分离培养难易及生物学特征的对比研究

目的 比较从人脐血和脐带中分离培养间充质干细胞（MSCs）的难易及两种不同来源MSCs的生物学特性,寻找最佳MSCs来源.方法 采用密度梯度离心法和组织块法分离培养人脐血MSCs和脐带MSCs.流式细胞术检测脐血和脐带源MSCs表面分子表型;采用丹参联合生长因子的方法诱导两种不同来源的MSCs向神经细胞分化.结果 脐带 MSCs原代分离培养成功率可达88%,而脐血MSCs分离培养成功率只有24%;脐带MSCs和脐血MSCs倍增时间分别为22h和38h;流式细胞术检测结果显示：两者具有相似的免疫表型,均表达黏附分子和基质细胞标记,不表达造血细胞标记、内皮细胞标记和HLA-DR;两种来源的MSCs在体外均可分化为樟经元样细胞.结论 脐带源 MSCs在生长速度、培养成功率上远高于脐血源 MSCs,在细胞表型及分化能力方面无差别.脐带 MSCs 是一种理想的 MSCs 来源.     

缺氧脐带间充质干细胞对脐血CD34＋祖细胞免疫反应的影响

目的：探讨脐带来源的缺氧间充质干细胞（MSCs）是否能有效抑制脐血CD34＋祖细胞免疫排斥反应,影响反应过程中免疫调节细胞因子的分泌。方法：从脐带中分离、培养MSCs,观察其生长形态,流式细胞术检测其表面标志;将缺氧处理后的脐带MSCs加到脐血CD34＋祖细胞、外周血单个核细胞（PBMc）共培养体系中,96h后收集上清液,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结栗：脐带MSCs不表达CD40、CD80、CD86、HLA—DR、CD34;缺氧的脐带MSCs能抑制共培养体系中淋巴细胞IFN-γ的分泌（与对照组比,P〈0．05）,同时促进IL-10分泌（与对照组比,P〈0．05）,但与非缺氧脐带MSCs组相比,IFN-γ的分泌量增多,IL-10的分泌量减少。结论：缺氧脐带MSCs能抑制脐血CD34＋祖细胞的免疫排斥反应,抑制IFN-γ的分泌,同时促进IL-10分泌,但与非缺氧脐带MSCs相比,免疫调节功能下调。     

人脐带间充质干细胞的体外分离、培养及诱导分化

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性.方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第1、5及10代细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD13、CD44、CD14、CD34与HLA-DR);化学染色(油红O、茜素红染色)及RT-PCR检测其体外诱导成脂和成骨分化的能力;RT-PCR检测胚胎十细胞特异性标志基因OCT-4.结果:体外培养4～6 d后,有细胞从组织块中游出;细胞传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变.培养细胞表达CD13与CD44,但CD14、CD34及HLA-DR呈阴性表达.体外诱导实验证实,该细胞具有成脂和成骨分化的能力.RT-PCR显示其表达OCT-4基因.结论:人脐带MSCs能在体外培养、扩增并且具有和骨髓MSCs类似的生物学特性,可作为组织工程种子细胞来源.     

人脐带间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的研究

目的：研究人脐带间充质干细胞（MSCs）详细的生物学特性,包括其细胞形态、免疫表型、纯度及增殖能力,从而建立稳定的MSCs体外分离培养体系。方法将剔除动静脉及内膜的新鲜人脐带组织剪切成1 mm3小块,用含10％胎牛血清的DM EM／F12培养,得到贴壁细胞。观察贴壁细胞形态,利用CCK‐8试剂盒测定生长曲线,流式细胞术研究特殊细胞表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105、CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA‐DR表达,并检测细胞周期。结果体外培养7～10 d后,可见细胞从组织块中游出;细胞主要呈纺锤体样、成纤维细胞样形态;生长曲线显示其增殖能力强;特殊表面抗原 CD29、CD73、CD90、CD105表达强阳性,造血性抗原标志CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA‐DR表达均呈阴性,流式细胞仪周期检测结果显示G0／G1期细胞超过80％。结论利用组织块法可有效获得人脐带 M SCs ,具有高纯度、低成本优点,并在体外较易培养、扩增。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、表型鉴定及标记

目的：探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为进一步研究MSCs干预器官移植的免疫排斥奠定基础。方法：采用直接贴壁法分离培养MSCs;通过流式细胞术检测细胞表面标志抗原CD90、CD45的表达率对培养的 MSCs进行表型鉴定;DAPI标记第3代MSCs,观察标记效率。结果:体外培养的原代MSCs 48 h内可见有少量贴壁细胞,7～10 d达到90%汇合;流式细胞术检测,第3代MSCs表面标记物CD90、CD45的阳性率分别为99.8%、6.8%, 提示MSCs表达CD90而不表达CD45;用DAPI进行细胞标记后,荧光显微镜下见所有MSCs均已被标记蓝色荧光,提示DAPI标记法敏感性好,标记效率高。结论：贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养SD大鼠MSCs的常规方法;DAPI标记可作为标记MSCs的一种有效手段。     

人脐带问充质干细胞在胶原支架材料体外复合培养的生物学特性研究

目的：观察体外人脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）黏附胶原蛋白支架条件下的干细胞免疫表型及成骨特性的变化,为复合载体移植提供实验依据。方法：将人脐带间充质干细胞静态接种于胶原蛋白支架上,经体外培养两周后,检测细胞在胶原蛋白材料中的干细胞CD44、CD105、HLA-DR、Ⅰ型胶原表达,观察细胞特性变化。结果：细胞在支架上有较好的粘附,CD 44、CD105、Ⅰ型胶原表达阳性,HLA-DR表达阴性。结论：混合培养中人脐带MSCs不仅与胶原蛋白有较好的组织相容性,且细胞在支架上培养仍保持了其干细胞的特点,Ⅰ型胶原表达阳性,提示具有潜在的成骨能力,为人脐带间充质干细胞组织工程体外预制提供实验基础。 更多还原     

骨髓间充质干细胞分离培养方法改进

目的本实验旨在建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。方法比较单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法(采用淋巴细胞分离液)结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs。结果成年人MSCs呈均一的成纤维细胞样,不表达造血谱系抗原CD14、CD34、CD45。结论利用密度梯度离心法(采用淋巴细胞分离液)结合贴壁培养法能有效分离纯化成年人MSCs,用此种方法培养的细胞具有MSCs的一般生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及影响因素

目的:建立人脐带血的间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增的方法。方法:无菌条件下取正常足月的脐带血,分离单个核细胞,以含5%胎牛血清的低糖DMEM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞,测定MSCs的生长曲线,用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果:脐血中的单个核细胞在适当的条件下分离、培养,获得的MSCs均一稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。结论:脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。     

3种人类间充质干细胞体外增殖能力和成脂能力的比较

目的: 从人足月胎儿的脐带组织和胎盘组织中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,观察人脐带组织MSCs（UC-MSCs）、胎盘组织MSCs（PL-MSCs）和胚胎组织MSCs（FT-MSCs）体外增殖能力和成脂分化潜能,为干细胞进一步应用于临床提供实验依据。方法: 无菌条件下获取人足月胎儿脐带组织和胎盘组织,通过Ⅰ型胶原酶酶解法分离出UC-MSCs和PL-MSCs,FT-MSCs由中科生物工程有限公司提供,取第3或4代MSCs进行检测。倒置显微镜观察细胞形态;活细胞计数法检测细胞增殖能力;流式细胞术测定UC-MSCs、PL-MSCs和FT-MSCs细胞周期并鉴定细胞表面标志物的表达阳性率。取3种组织来源的第3代MSCs进行成脂诱导,诱导18 d进行油红O染色,观察并比较3种不同组织来源MSCs的成脂能力。结果：从3种不同组织中均可获取梭形贴壁的MSCs,表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105均呈阳性表达,CD14、CD34和CD45均为阴性表达;FT-MSCs增殖能力明显强于UC-MSCs和PL-MSCs（P<0.01）,FT-MSCs、UC-MSCs和PL-MSCs的增殖指数（PI）分别为(36.66±1.30)%、(18.23±1.10)%和(10.03±1.20)%,3种MSCs的PI比较差异均有统计学意义(P<0.01)。3种MSCs经过成脂诱导液诱导后,油红O染色结果均为阳性,但是UC-MSC s体外成脂能力(油红O染色阳性率)明显强于FT-MSCs和PL-MSCs(P<0.01)。结论：3种不同组织来源MSCs在形态和细胞表面标记物等方面相似,FT-MSCs具有更强的增殖能力和增殖活性,UC-MSCs具有更强的体外成脂潜能。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

人脐血间充质干细胞的体外培养及生物学特性

目的:建立一种体外纯化增殖人脐血源性间充质干细胞(MSCs)的实验方法,并观察其生物学特性。方法:从正常分娩的足月胎儿脐血中分离出MSCs进行原代培养,培养瓶预先用自体血浆包被处理。72-96 h半量更换培养液,弃去未贴壁细胞,以后每3-5 d半量换液1次。待细胞达到80%-90%融合时,按1∶2的比例进行传代。倒置或相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况及形态学特征。取第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45的表达。结果:脐血经分离、培养5-7 d后有间充质样细胞贴壁,3-4周后,细胞生长达80%-90%融合,形态学类似骨髓源性MSCs。连续传至5代以后,增殖能力未见明显减弱。脐血MSCs的大部分细胞(>90%)处于G0/G1期,且均一稳定地表达间充质干细胞表面抗原CD29、CD44,但不表达CD34、CD45。结论:脐带血内含有MSCs,并可在体外纯化增殖,该技术可为实验研究和临床应用提供足够的干细胞来源。     

人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

目的 从脐血中获得间充质干细胞（MSC），探索体外诱导MSC向肝细胞分化的实验条件。方法 无菌采血，分离脐血单个核细胞。以贴壁培养法获得MSC，采用流式细胞术检测细胞表面标志。分别用联合诱导法(联合诱导组)以及阶段诱导法(阶段诱导组)诱导MSC向肝细胞分化。采用RT-PCR检测ALB、AFP及CK19mRNA的表达情况。结果 MSC呈长梭形，第三代（P4）后增殖较快。流式细胞术检测表明：CD29及CD44阳性，而CD34及CD45阴性。诱导6周后，联合诱导组无变化，而阶段诱导组细胞由长梭型变为不规则型，并检测到AFP mRNA的阳性表达,而未见ALB、CK19 mRNA的表达。继续诱导2周，检测到AFP、ALB、CK19 mRNA的表达。结论 脐血中的MSC对高密度、高血清的依赖性高。在体外，阶段诱导方法可将MSC诱导成肝细胞。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养与扩增实验研究

目的探讨脐血来源的人间充质干细胞（HMSCs）在体外分离培养与扩增的可行性。方法在无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经复合枸橼酸钠抗凝,用相对密度为1．077g／L的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以30％胎牛血清进行培养和扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞接种于特定培养基后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,经传几代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达GD14、CD19,强表达CD105、CD44。结论来源于人脐血的MSCs在体外可以分离培养、扩增,为MSCs的进一步研究奠定基础。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。