血管内皮抑素的原核表达及多克隆抗体的制备

背景与目的：本实验拟在原核系统中表达并纯化人血管内皮抑素（endostatin),制备鼠抗人血管内皮抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增内皮抑素的cDNA,重组人原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,应用纯化产物免疫3只小鼠。结果：构建成制备人血管内皮抑素的原核表达载体pQE-30,并转化入大肠杆菌BL21中得到表达产物,经Ni亲和层析柱纯化后进行SDS-PAGE鉴定结果为单一组分。利用纯化的人血管内皮抑素成功制备高滴度的鼠抗人血管内皮抑素多克隆抗体,并由Western blot分析证实。结论：高纯度表达产物及多克隆抗体的制得为今后的研究提供了素材。     

血管生成抑素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：研究CpG联合非复制重组痘苗病毒在肿免疫治疗中的效果。方法;构建非复制重组痘苗病毒v△11β75,联合应用免疫刺激寡核苷酸和重组痘苗病毒v△11β75进行肿瘤免疫治疗。结果：重组痘苗病毒v△11β75在人源143细胞中的不能正常繁殖,Southern-blot证实痘苗病毒天坛株HindⅢC,K片段间基因的缺失,在Wistar大鼠的Walker's肿瘤模型中,联合应用CpG-ODN和非复制痘苗病毒修饰的WRC256细胞裂解物进行免疫治疗,可以延长荷瘤鼠的生存期,肿瘤生长速度降低。结论：CpG-ODN可以增强非复制痘苗病毒修饰的肿瘤细胞裂解物的抗肿瘤治疗效果,为肿瘤免疫治疗提供了一种新的途径。     

癌基因LMO3的原核表达及多克隆抗体的制备及应用

目的:制备抗神经特异性表达的癌基因LMO3的多克隆抗体,进行LMO3分子检测和功能研究.方法:采用RT-PCR方法扩增LMO3的基因序列,构建其原核表达载体pET32a-LMO3.在大肠埃希菌中诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE分离纯化原核表达的融合蛋白,PBS溶解聚丙烯酰胺凝胶颗粒中的融合蛋白,乳化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体.采用免疫印迹、免疫组化等对该抗体的特异性进行鉴定.结果:构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实序列正确.经诱导表达在相对分子质量为37×103处有一条明显的蛋白条带,与预期值一致;免疫动物所得抗血清效价为1∶16 000,该抗体能够识别原核表达的LMO3蛋白及细胞内源性表达的LMO3蛋白;免疫组化显示,LMO3在SHG44胶质瘤细胞株及脑胶质瘤组织中均有表达. 结论:制备了能识别天然LMO3分子的抗LMO3的多克隆抗体,为检测LMO3分子的表达和进一步研究其功能提供了有力的工具.     

一种新型肿瘤血管生成抑制因子——血管稳定素的研究进展

为了研究原发性肿瘤抑制其转移瘤生长的分子机制，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等从一个原发性肺肿瘤抑制其转移瘤的小鼠模型上，分离纯化到一个由原发瘤产生的抑制肿瘤血管生成和转移瘤生长的多肽，并命名为血管稳定素。     

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的：在原核系统中表达并纯化人血管生成抑素（angiostatin),制备鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化,再用纯化的人血管生成抑素免疫小鼠并制备多抗。结果：通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表在并纯化成功,再利用纯化的人血管生成抑素制备成功鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。结论：表达产物及多克隆抗体为下阶段深入研究提供了重要的实验材料。     

血管生成抑制因子的研究进展

血管生成与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关,目前,以抑制血管生成为靶点治疗肿瘤有望成为抗肿瘤新疗法之一。近年来,研究发现了多种内源性血管生成抑制因子,其中一些已进入了临床试验阶段。本文对内源性血管生成抑制因子的结构、功能、作用机制及其在肿瘤治疗中的应用进行综述。     

血管生成抑制素Endostatin研究新进展

１９９７年Ｏ‘Ｒｅｉｌｌ从小鼠血管内皮细胞瘤中分离到一种新的２０ｋＤ具有特异抑制血管内皮细胞生长的抑制因子－－Ｅｎｄｏｓｉａｔｉｎ,它对牛它细血管内皮细胞、牛肺主动脉内皮细胞有特异的抑制增殖作用,而对非血管内皮细胞系细胞如ＮＩＨ３Ｔ３,Ａ１０平滑肌细胞等则无增殖抑制作用,实验证实大肠杆菌生产的复性及未复性的Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ及杆状病毒生产的重组Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ均有抑制鸡胚血管生成的作用,而且     

血管生成抑制素抑制胃癌浸润转移的研究

从人血浆中分离出血管生成抑制素(Angiostatin),并以此进行胃癌转移模型治疗试验,以探讨血管生成抑制素抑制胃癌浸润转移的作用.以Sepharose亲和层析柱从血浆成分中分离出纤溶酶原,再用弹性蛋白酶酶切,经Sepharos 4B-Lysine亲和层析柱分离出血管生成抑制素.以完整组织块裸鼠胃壁内原位种植建立胃癌转移模型,肿瘤种植当天给实验动物24μg(1.2mg/kg)血管生成抑制素腹腔内注射,以后每天给以12μg(0.6mg/kg);以相同剂量的纤溶酶原腹腔内注射作为对照,相同体积的生理盐水腹腔内注射作为空白对照;治疗共进行3周,肿瘤种植后10周处死实验动物,测量肿瘤体积,观察转移情况,免疫组化法检测肿瘤微血管密度.结果:     

乳腺癌组织和血清中内皮细胞抑制素VEGF表达与肿瘤血管生成

目的:研究乳腺癌患者癌组织和血清内皮细胞抑制素(ES)、VEGF表达和肿瘤血管生成间的关系,初步探讨乳腺癌血管生成调节机制.方法:采用免疫组化法检测59例乳腺癌组织ES、VEGF表达及其微血管密度(MVC);分别采用竞争性酶联免疫试验和ELISA测定患者乳腺癌组织和手术前、后血清ES及VEGF水平.结果:1)癌组织ES、VEGF阳性表达率分别为69.5%和59.3%,明显高于癌旁组织(P＜0.005).2)手术前乳腺癌组血清ES和VEGF水平显著增高;手术3周后,血清VEGF水平明显下降,而ES仍保持在较高水平.3)癌组织VEGF表达、组织和血清VEGF水平间具有密切相关性(P＜0.05);癌组织ES表达和血清ES水平间仅有弱的关联(P=0.06).4)癌组织VEGF阳性和阴性组,MVC分别为37.5±10.3和22.8±8.3,有显著性差异(P＜0.001),且血清VEGF浓度与MVC呈正相关(P＜0.0001,r=0.63);癌组织VEGF表达阴性组,血清ES与MVC显示负相关(P=0.03,r=-0.45).结论:VEGF是促进乳腺癌血管生成的直接相关因子,而ES可能是肿瘤及其转移的血管生成负调控因子.     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N1乙酰基转移酶(SSAT)的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备.方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆茵细胞.SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化.用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测.结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆茵中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高.结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体.     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N¹乙酰基转移酶（SSAT）的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备。方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞。SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化。用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测。结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆菌中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高。结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体。     

Snail/GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

引言上皮型钙粘附素(E-cadherin,E-cad)介导的粘附系统的破坏,是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤[1]。而锌指转录因子Snail,具有下调E-cad的作用[2],本研究通过制备Snail抗体,为进一步开展E-cad的功能研究和应用奠定了基础。1材料和方法1.1主要试剂和菌株主要试剂购自北京中山公司;大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。1.2 pGEX-4T-1/Snail原核表达载体的克隆从人血管内皮细胞提取总RNA,在逆转录酶作用下,合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板,用上游引物5′-CT-GCAGGACTCTAATCCAG-3′(含有EcoRI内切酶位点)和下游引物5′-ATCCTTGGCCTCAGAGAGC-3′(含有Sal I内切酶位点),进行PCR扩增,得到Snail C-末端377bp的DNA片断;酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后,用玻璃奶法(自制)纯化回收,与pGEX-4T-1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌,提取质粒并酶切鉴定重组体。1.3融合蛋白的诱导表达与纯化1.3.1表达鉴定表达质粒Snail/pGEX-4T-...     

抗前列腺癌γ-精浆蛋白人源Fab抗体的原核表达和特性鉴定

对从噬菌体抗体库筛选的抗γ-精浆蛋白（γ-sm）人源化Fab抗体进行表达纯化和生物学特性鉴定,为其应用于前列腺癌抗体导向酶－前药治疗奠定基础。方法：首先将重组表达载体γ-sm-hFab/pComb3X转化大肠杆菌并诱导其可溶性表达,亲和纯化后采取Western-blot检测表达产物对γ-sm抗原结合特异性。其次分别采用抑制ELISA和竞争抑制ELISA方法分析表达纯化的抗γ-sm人源Fab抗体的亲和力和结合表位。最后采用竞争抑制流式细胞术和免疫组化超敏S－P法鉴定制备纯化的人源Fab抗体在前列腺癌细胞和组织上的结合分布特性。结果：成功诱导表达和纯化出理论分子量大小可溶性Fab抗体蛋白,含量约占细菌总可溶性蛋白的20.5%,Western-blot证实其能特异性结合识别γ-sm。抑制ELISA显示其表观结合常数（Ka）为0.78×108 M-1,亲和力约为亲本鼠源单抗E4B7的37.5％,竞争抑制ELISA进一步显示,二者识别γ-Sm抗原蛋白上的表位相同。流式细胞术和免疫组化显示,表达纯化的人源Fab抗体可显著地与前列腺癌细胞和组织特异性结合,其结合主要分布在腺上皮内瘤和中低度恶性的前列腺癌组织上。结论：成功地对筛选的抗γ-sm人源Fab抗体进行了原核可溶性表达、纯化和免疫生物学特性鉴定,为其进一步应用于抗体导向酶－前药实验治疗前列腺癌奠定了基础。     

重组人血管抑素的克隆、表达及活性测定

目的：研究血管抑素（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法：ＲＴ－ＰＣＲ从胎儿肝脏钓取人血管抑素全编码区ｃＤＮＡ,使用Ｐｉｃｈｉａ分泌型酵母表达系统表达重组人血管抑素,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果：重组人血管抑素在酵母系统中得到较高量表达（５ｍｇ／Ｌ）,经肝素亲和层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示分子量为４３ｋＤ。活性实验表明,重组蛋白能够抑制新生管形成、抑制伤口愈合。结论：重组人血管抑素在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。     

人血管抑素克隆表达及抑制血管生成的研究

目的　研究并获得重组人血管抑素 (angiostatin) ,探讨其临床应用价值。方法　采用逆转录 -聚合酶链式反应 (RT PCR )方法 ,从人胚胎肝细胞中扩增出人全长血管抑素cDNA片段。用原核细胞表达载体构建 pBV 2 2 0 /angiostatin重组质粒 ,并将其转化大肠杆菌DH 5α进行表达 ,初步纯化。应用鸡胚尿囊膜血管生成实验及脐静脉内皮细胞增殖实验检测其活性。结果　经SDS PAGE分析 ,表达产物相对分子量约 3 8kD ,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的 3 0 %。活性实验显示 ,重组蛋白能够抑制血管形成。结论　重组人Angiostatin在大肠杆菌中实现高效表达 ,并具有很好的生物学活性     

TRAIL基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的:观察罗勒多糖对肿瘤细胞不同途径转移行为的影响,并从细胞间通讯功能的恢复以及体内NK细胞活性的变化两方面探讨其抗肿瘤转移的可能作用机制.方法:Metfigel穿膜法体外观察罗勒多糖对肿瘤细胞移动活性的影响;建立不同途径的肿瘤转移模型,体内观察罗勒多糖对肿瘤转移行为的影响.SLDT技术检测罗勒多糖对细胞通讯功能的影响;51Cr释放法检测罗勒多糖对NK细胞活性的影响.结果:罗勒多糖在体内外均具有显著的抗肿瘤转移作用;与对照组相比细胞间通讯功能有一定程度的恢复;NK细胞的活性明显提高.结论:罗勒多糖具有明显的抗肿瘤转移作用,可能是一种具有潜在开发价值的新的抗肿瘤转移药物,其抗肿瘤转移作用是通过多个药效靶点综合作用的结果.     

RNA类药物在疾病治疗中的研究进展

RNA类小分子可作为治疗性药物应用于各类疾病的治疗.这类小分子主要包括基因表达抑制剂、基因修复剂、蛋白拮抗剂及RNA疫苗,目前已有多种反义RNA和核酶作为基因表达抑制剂正在进行各期临床试验,它们主要用于心血管疾病、肿瘤、药物代谢性疾病、病毒性肝炎和艾滋病等疾病的治疗.蛋白拮抗剂aptamers已作为治疗老年性黄斑和血栓药物进入临床Ⅱ,Ⅲ期试验.RNA疫苗作为免疫调节剂治疗前列腺癌和肾癌的临床试验也在进行中.