膝关节滑膜间质干细胞分离、培养及其多向分化潜能特性的研究

目的 探讨晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymalstem cells,SMSCs)体外分离、培养的可行性及其在体外向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化的特性.方法 取膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞.挑选单细胞克隆,筛选获得SMSCs.流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原标志.培养至第三代,分别向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化.油红O染色鉴定向脂肪细胞分化;碱性磷酸酶染色、茜素红染色鉴定向成骨细胞分化;甲苯胺蓝染色鉴定向软骨细胞分化.RT-PCR检测脂肪细胞、成骨细胞标志基因.Ⅱ型胶原免疫组化染色检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达.结果 原代SMSCs体外培养呈葵花样细胞集落,传代后可见圆形巨噬样细胞和纺锤形成纤维样细胞,融合后呈成纤维细胞样生长.CD44、CD90呈阳性,CD34、CD71和CD45呈阴性.向脂肪细胞诱导21d,油红O染色阳性;RT-PCR检测有脂蛋白酶、乙二腈及PPARγ2表达;向成骨细胞诱导7、28 d,ALP,茜素红染色阳性,有ALP、Osteopontin及Osteocalcin表达;向软骨细胞诱导21d,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.结论 晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织可以分离、培养获得SMSCs. SMSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能.     

共培养系统下软骨细胞对骨髓间质干细胞向软骨细胞分化的诱导作用

 目的观察共培养系统下正常软骨细胞和关节炎软骨细胞对骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向软骨细胞分化的促进作用。方法分离新西兰兔 BMSCs及正常软骨细胞。制作兔膝关节炎模型,提取兔关节炎软骨细胞。将 BMSCs与低熔点琼脂糖复合成凝胶块,构建软骨细胞-BMCSs共培养系统,分为正常软骨细胞 P0-BMSCs组、正常软骨细胞 P3-BMSCs组、关节炎软骨细胞 P0-BMSCs组、关节炎软骨细胞 P3-BMSCs组及 BMSCs组(对照组)。在 3、7、14天取材行实时定量 PCR、糖胺聚糖含量、细胞活性检测及组织切片观察。结果(1)正常软骨细胞 P0-BMSCs组的 II 型胶原基因表达增强,在 3、7、14天分别为对照组的 5.1、7.2、11.2倍; 正常软骨细胞 P3-BMSCs组 I 、 II 型胶原及蛋白聚糖基因表达均未见增强; 关节炎软骨细胞 P0-BMSCs组蛋白聚糖基因表达增强,在 14天为对照组的 7.8倍; 关节炎软骨细胞 P3-BMSCs组 I 型胶原基因表达水平在三个时间点均低于对照组。(2)正常软骨细胞 P0-BMSCs组糖胺聚糖含量为对照组的 2.59倍。除关节炎软骨细胞 P0-BMSCs组外,其余三组与对照组比较差异均有统计学意义。阿新蓝染色各组均为阳性,正常软骨细胞 P0-BMSCs组的细胞及细胞外基质蓝染最深。结论兔正常 P0软骨细胞与兔关节炎 P0软骨细胞能够有效促进 BMSCs向软骨细胞分化,正常 P3软骨细胞的促分化作用微弱,而关节炎 P3软骨细胞不具有促分化作用。     

间充质干细胞及其来源的外泌体在骨关节炎治疗中的研究进展

骨关节炎（OA）是最常见的慢性退行性骨关节疾病,由于软骨的自愈能力有限,目前的治疗策略对OA无法达到治愈效果。近年来,越来越多的证据表明间充质干细胞治疗OA可获得较好的疗效。深入研究表明,间充质干细胞的旁分泌机制可在机体异常条件下发挥抗炎、免疫调节作用,而外泌体可能在此机制中扮演着重要的角色。外泌体可通过调控细胞间信号转导、损伤组织修复及免疫调节等过程,从而延缓OA进程。间充质干细胞及其来源的外泌体为治疗OA提供了新的治疗策略,但仍需更大量及大型动物研究以更好的验证间充质干细胞及其来源的外泌体用于治疗OA的生物安全性和治疗特征。本文就间充质干细胞及其来源的外泌体在OA中的作用及机制作一综述。     

微小RNA-564基因下调对滑膜间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探究下调微小RNA-564(miR-564)基因对滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。 方法取第3代的人滑膜间充质干细胞(SMSCs)作为实验细胞,实验设计为3组：SMSCs空白对照组(空白组);miRNA抑制剂转染SMSCs对照组(对照组);miR-564抑制剂转染SMSCs实验组(实验组)。将3组SMSCs同时成软骨诱导培养,观察诱导后软骨细胞的组织形态,并检测诱导前7 d内的3组细胞增殖曲线,和软骨分化特异性基因和蛋白[Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、母亲DPP同源物4(Smad4)];本次实验所有数据均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。 结果甲苯胺蓝染色观察细胞形态与特点基本符合软骨细胞,实验组细胞数量更多,蓝染更明显;细胞增殖曲线表明实验组细胞增殖速度明显快于对照组(F＝0.842, P <0.01);RT-PCR检测与Western Blotting检测表明实验组软骨细胞分化特异基因和蛋白表达较对照组明显升高(F＝2274.75, F＝447.31, F＝30476.22; P <0.01),并且实验组TGF-BMP关键基因及蛋白Smad 4有所升高(F＝457.02, P <0.01)。 结论下调miR-564基因的表达可促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖与分化,并且有可能是通过作用于TGF-BMP通路实现。     

人骨髓间质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间质干细胞（MSC）在体外培养条件下能否定向诱导分化为表皮细胞。方法抽取无造血系统恶性疾病的成人骨髓标本，采用Percoll细胞分离液（1．073g／ml）分离MSC，在体外传代培养至第3代，分为对照组和实验组。两组分别用普通L-DMEM培养基和含表皮生长因子、胰岛素、维甲酸、氯化钙的L-DMEM培养基诱导7d。在倒置相差显微镜下每天观察两组细胞的形态；采用免疫组织化学法检测P63和广谱细胞角蛋白（PCK）的表达情况。结果实验组细胞由长梭形逐渐转变为扁圆形或形态不规则，部分细胞P63和PCK呈阳性表达；对照组细胞持续呈长梭形，P63和PCK未见表达。结论人骨髓MSC在体外可诱导分化为表皮细胞。     

Titanium particles suppress expression of osteoblastic phenotype in human mesenchymal stem cells.

Long-term stability of arthroplasty prosthesis depends on the integration between osseous tissue and the implant biomaterial. Integrity of the osseous tissue requires the contribution of mesenchymal stem cells and their continuous differentiation into an osteoblastic phenotype. This study aims to investigate the hypothesis that exposure to wear debris particles derived from orthopaedic biomaterials affects the osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSC). Upon in vitro culture in the presence of osteogenic supplements (OS), we observe that cultures of hMSCs isolated from femoral head bone marrow are capable of osteogenic differentiation, expressing alkaline phosphatase, osteocalcin, and bone sialoprotein (BSP), in addition to producing collagen type I and BSP accompanied by extracellular matrix mineralization. Exposure of OS-treated hMSCs to submicron commercially pure titanium (cpTi) particles suppresses BSP gene expression, reduces collagen type I and BSP production, decreases cellular proliferation and viability, and inhibits matrix mineralization. In comparison, exposure to zirconium oxide (ZrO2) particles of similar size did not alter osteoblastic gene expression and resulted in only a moderate decrease in cellular proliferation and mineralization. Confocal imaging of cpTi-treated hMSC cultures revealed patchy groups of cells displaying disorganized cytoskeletal architecture and low levels of extracellular BSP. These in vitro findings suggest that chronic exposure of marrow cells to titanium wear debris in vivo may contribute to decreased bone formation at the bone/implant interface by reducing the population of viable hMSCs and compromising their differentiation into functional osteoblasts. Understanding the nature of hMSC bioreactivity to orthopaedic wear debris should provide additional insights into mechanisms underlying aseptic loosening.     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）联合成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor-4，FGF4）诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HMSCs）向肝细胞方向分化的能力。方法分别用HGF、FGF4、HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞。在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）；免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、白蛋白（albumin，ALB）的表达；RT—PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果HMSCs经诱导向肝样细胞转化。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达，图像分析表明HGF＋FGF4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高，HGF次之，FGF4则较弱；免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达；各诱导组RT—PCR均可检测出AFP和ALBmRNA的表达，而阴性对照组则没有表达。结论HGF、FGF4、HGF＋FGF4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞，分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高。     

骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞的分化潜能

目的：观察骨髓间充质干细胞在体外分化成淋巴管内皮细胞的可能性。方法：采用密度梯度离心法分离成人骨髓间充质干细胞,体外扩增,流式细胞术检测细胞表面标志。用内皮细胞培养基EGM-2培养,加入VEGF-C（156s）诱导后,相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测淋巴管内皮细胞特异性标志物Podoplanin和VEGFR-3,RT-PCR检测相应基因的表达。成管实验检测分化的淋巴管内皮细胞的功能。结果：分离培养的骨髓间充质细胞形态上为纤维样,经流式细胞术测定表达CD90、CD105,其阳性表达率分别为90.03%、97.86%,而CD14、CD34、HLA-DR的阳性阳性率分别为2.00%、2.18%、1.56%。经诱导刺激后,间充质干细胞呈鹅卵石样外观,Podoplanin和VEGFR-3的表达率分别为26.25%和12.70%。RT-PCR结果显示特异性的条带,成管实验显示诱导后的淋巴管内皮细胞具有成管的功能。结论：从骨髓中可以提取到骨髓间充质干细胞,在内皮细胞培养基和VEGF-C（156s）的诱导下骨髓间充质干细胞可以分化为淋巴管内皮细胞。     

重组人骨桥蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞向间质细胞转化的研究

目的 观察骨桥蛋白(OPN)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)向间质细胞转化(EMT)的影响.方法 依据加入的重组人骨桥蛋白(rhOPN)的浓度,将HK-2细胞分成6组,rhOPN的浓度依次为:0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/L,刺激时间为48h.采用共聚焦显微镜观察细胞形态学变化;实时定量聚合酶链反应(PCR)、Western blot检测E-钙黏素(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)的表达;应用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡.结果 在形态学上,rhOPN能够刺激HK-2细胞向间质细胞转变,通过实时定量PCR、Western blot分析发现上皮细胞的表面标记E-cad随着刺激浓度的增加而逐渐降低,间质细胞的标记物α-SMA、FN的表达逐渐升高,实时定量PCR检测E-cad依次为:1947.0±301.0、1114.0±187.4、668.7±180.4、436.7±121.8、242.7±105.2、223.5±73.4; α-SMA依次为:0.01465±0.003 38、0.034 28±0.01200、0.06034±0.005 65、0.09205±0.010 68、0.11360±0.018 92、0.186 30±0.021 75;FN依次为:0.000 818±0.000103、0.001 341±0.000203、0.001 708±0.000128、0.002 170±0.000161、0.003 369±0.000314、0.004961±0.000364.Western blot检测E-cad依次为:1.719±0.159、1.370±0.016、1.238±0.031、0.916±0.056、0.520±0.065、0.456±0.073;α-SMA依次为:0.623±0.127、0.640±0.031、0.865±0.045、1.015±0.107、1.290±0.103、1.381±0.040; FN依次为:0.475±0.044、0.499±0.062、0.904±0.066、0.981 ±0.052、1.272±0.093、1.614±0.056,各组之间差异有统计学意义(均P＜0.05),且随着OPN刺激浓度的增加,细胞的抗凋亡能力也逐渐增强.结论 OPN能够刺激HK-2细胞向间质细胞转化,且呈现出明显的剂量依赖性.     

Differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells into Schwann-like cells in vitro

Bonemarrowmesenchymalstemcells, alsocalledbonemarrowstromalcells (BMSCs), areisolatedfrombonemarrow, andtheycanmultiplyinvitroanddifferentiateintoosteogeniccells,chondrocytes, adipocytes, musclecellsandneuralcells.1 5 RecentstudieshavedemonstratedthatBMSCsfromadultratscoulddifferentiateintoSchwann likecellsinspecificconditions.6, 7 BMSCsmayhavepotentialapplicationforautologousneuraltransplantation. Inthisstudy, wetrytoinvestigatethedifferentiativecapabilityofadulthumanBMSCsintoSchwann l…     

人体瘢痕疙瘩前体细胞的分离培养及向脂肪细胞的定向诱导分化

目的 研究人体瘢痕疙瘩来源的前体细胞(keloid-derived precursor cell,KPC)的体外分离、扩增方法,及其在特定培养基条件下向脂肪细胞的诱导分化,探讨其作为组织工程脂肪种子细胞的可能性.方法 取人体瘢痕疙瘩组织在改良L-DMEM培养基条件下培养,传代后以流式细胞仪检测其间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)相关基因表达,并以特定H-DMEM培养基[含1 μmol/L的地塞米松,0.5 mmol/L的3异丁基-1甲基黄嘌呤(3-IBMX),10 mg/L牛胰岛素,100 mmol/L的消炎痛,10％的胎牛血清(FBS)]诱导,在相差显微镜下观察,油红O染色测定脂滴生成.结果 超过95％的KPC表达CD29、CD44、CD90/Thy-1和CD105;几乎不表达CD45和CD34(1.0％～2.5％);且诱导后该细胞渐增大,由梭形变为圆形或多角形,72 h出现脂滴,19d油红O染色细胞阳性率78.6％.结论 KPC能表达多种MSC表面标志物,不表达造血干细胞(hemopoietic stem cell,HSC)标志物,能够在诱导培养基条件下分化为脂肪细胞,可能成为组织工程脂肪的一种新种子细胞来源.     

Paracrine regulation of fetal lung morphogenesis using human placenta-derived mesenchymal stromal cells

Background

Recent experimental work suggests the therapeutic role of mesenchymal stromal cells (MSC) during perinatal lung morphogenesis. The purpose of this study was to investigate the potential paracrine effects of human placenta-derived mesenchymal stromal cells (PL-MSCs) on pulmonary development.

Methods

Human MSCs were isolated from preterm placental chorion. Normal E14.5–15.5 fetal rat lungs were subsequently harvested and cultured ex vivo in the presence of conditioned media from PL-MSCs for 72 h. The lungs were analyzed morphometrically and by quantitative DNA, protein, and gene expression. Postnatal human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells and neonatal foreskin fibroblasts (FF) were used as controls.

Results

The MSC phenotype of the isolated placental cells was confirmed. Compared with lungs cultured in the absence of PL-MSCs, fetal lung growth was markedly accelerated on exposure to PL-MSC conditioned media as demonstrated by increases in Δlung surface area, terminal bud formation, and Δterminal bud formation. Pulmonary growth was predominantly impacted by enhanced branching morphogenesis, as shown by 73.5 ± 6.1 terminal buds after stimulation with PL-MSCs compared with 46.7 ± 5.7 terminal buds in control unconditioned media (P < 0.05). Significant differences were noted favoring PL-MSCs over FFs based on terminal bud formation and Δterminal bud formation (P < 0.05). There was significant upregulation of club cell secretory protein in lungs exposed to PL-MSCs compared with all other groups.

Conclusions

These data suggest that human PL-MSCs are potent paracrine stimulators of pulmonary morphogenesis in a fetal organ culture model. Cell therapies based on autologous or donor-derived PL-MSCs may represent a novel strategy for enhancing perinatal lung growth.     

白细胞介素-23通过Smad4调控间充质干细胞成骨分化的机制研究

目的 研究白细胞介素23（interleukin-23,IL-23）对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）成骨分化的作用,并探讨其机制。方法 分离培养小鼠骨髓MSC,在IL-23刺激下进行成骨诱导分化,通过茜素红实验与碱性磷酸酶实验明确其成骨分化能力;通过全基因组表达谱芯片检测IL-23刺激下MSC成骨分化过程中的基因表达谱,筛选IL-23调控MSC成骨分化的关键基因,并通过荧光定量PCR加以验证;通过siRNA干扰关键基因Smad4表达,并用茜素红实验与碱性磷酸酶实验明确MSC成骨分化能力改变。结果 在成骨诱导分化条件下,IL-23刺激的MSC茜素红实验与碱性磷酸酶实验结果均显著高于无IL-23刺激的对照组;全基因组表达谱芯片结果显示,IL-23刺激下MSC成骨分化过程中Smad4表达明显上调;siRNA干扰Smad4表达后,IL-23刺激引起的MSC成骨能力增强被明显抑制。结论 IL-23通过上调Smad4表达以促进MSC成骨分化。     

小鼠羊水间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的  探讨小鼠羊水间充质干细胞（AF-MSC）的分离、培养及鉴定。方法  在无菌条件下获取孕鼠子宫,收集羊水后进行过滤和离心,对沉淀细胞团进行培养并传代。观察AF-MSC的形态,分析AF-MSC的增殖特点,采用流式细胞术鉴定AF-MSC的表面标志物,检测AF-MSC的三系分化能力及冷冻复苏后的细胞活力。结果  小鼠AF-MSC呈典型的梭形,融合度 > 80%时会出现典型的漩涡状结构。小鼠AF-MSC传代培养无明显潜伏期,培养2~3 d进入对数增长期,增长速度最快,之后增殖速度减慢,进入平台期。AF-MSC表达干细胞抗原（Sca）-1、CD29、CD44,不表达CD34、CD45。小鼠AF-MSC成骨分化后,矿化结晶被茜素红染成深红色的点状;成软骨分化后,分泌的酸性粘多糖被阿利新蓝染成淡蓝色;成脂分化后,胞质脂滴被油红O染成红色。细胞冷冻复苏后存活率 > 95%,生长状态良好,6 d时增殖能力高于冻存前（P < 0.05）,其他时间增殖能力与冻存前比较,差异无统计学意义（均为P > 0.05）。结论  本实验成功分离了小鼠AF-MSC,过程简便、成本低,且分离的细胞可随传代次数的增加而纯化,冻存不影响其增殖能力。     

软骨细胞和骨髓间质干细胞混合培养构建组织工程软骨的实验研究

目的 探讨软骨细胞和骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)混合培养对构建组织工程软骨的影响,并确定两者的最佳比例.方法 体外分离培养兔(1月龄)关节软骨细胞和BMSCs,按不同比例(软骨细胞和BMSCs的浓度比为:4:1、2:1、1:1、1:2、1:4及单纯软骨细胞)混合培养一代.以4×107/ml的细胞终浓度接种40μl于聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA:4mm×4mm×2mm),静态培养2 d,然后移至周期性压力场(压力0～200 kPa,频率:0.1 Hz,时间:8 h/d)培养3周.收获组织工程软骨行大体观察,组织切片,定量检测糖胺聚糖(glyeosaminoglycans,GAGs)含量、DNA含量及Ⅱ型胶原染色面积.结果 软骨细胞和BMSCs混合培养组与单纯软骨细胞组相比,体积较大,表面光滑,有弹性,有光泽.组织学检查显示混合培养组结构致密,细胞外基质分布更均匀,其中软骨细胞和BMSCs的浓度比为2:1组可见软骨陷窝.混合培养组的Ⅱ型胶原染色面积、GAGs含量、DNA含量高于单纯软骨细胞组,其中软骨细胞和BMSCs的浓度比为2:1组含量最高,与其他比例混合组比较,差异有统计学意义.结论 软骨细胞和BMSCs混合培养能提高组织工程软骨的质量,其中以软骨细胞和BMSCs的浓度比为2:1最佳.     

不同年龄人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的研究

目的 :观测年龄对人骨髓间充质干细胞 (humanmesenchymalstemcells ,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响。方法 :使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察细胞生长情况 ,检测其增殖活性、碱性磷酸酶活性 (ALP)、诱导后骨钙素定量测定。结果 :低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、MTT、ALP及骨钙素浓度高。结论 :hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.