利用α—factor启动子在酵母中表达乙型肝炎表面抗原基因

利用酵母α-factor分泌型启动子构建大肠杆菌—酵母菌穿梭质粒。将乙型肝炎表面抗原基因(HBsAg基因)经过调正读码框架使其准确地和表达载体相连接,最终在酵母中成功地表达HBsAg蛋白并分泌到细胞外。     

φ10启动子控制下大肠杆菌中rhNTA表达的乳糖诱导

采用乳糖作为诱导物，对φ启动子控制下重组蛋白rhNTA（a new thrombolytic agent）在大肠杆菌中的表达进行研究，结果为培养12h（诱导6h）后湿菌体重量86．0－100．2g/L、目标蛋白占细胞总蛋白的40％－50％。研究了关键基质组分、乳糖诱导等对表达的作用。结果表明，基础料和补充氮源中酵母膏的比例、诱导时机和乳糖流加方式等对表达量的提高有明显的影响。实验显示，采用乳糖诱导时重组蛋白的可溶性部分占有较大的比例。     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

[目的]山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。[方法]利用PCR点突变方法改造山蛭素基因，将山蛭素基因克隆到pGEM-Teasy载体中，对重组质粒测序，构建了毕赤酵母表达载体pPIZB-Hs，然后转化有活性的GS115酵母菌株，筛选表达酵母菌株GS115，摇瓶发酵。[结果]改造的山蛭素基因在重组酵母中表达，重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。[结论]利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因，并能在毕赤酵母中表达。     

弓形虫表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的：探讨毕赤酵母能否高效表达具有生物学活性的弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2／B重组蛋白（P30-CTA2／B）。方法：将目的基因定向亚克隆入pGAPZαA表达载体。构建酵母表达载体pGAPZαA-P30-CTX;线性化重组酵母表达载体,电穿孔法导入毕赤酵母GS115。抗生素Zeocin筛选、PCR法鉴定阳性转化子;酵母工程菌摇瓶表达,取上清液行SDS-PAGE和Westem blotting分析。结果：在毕赤酵母菌中分泌表达P30-CTA2／B重组蛋白,产量高达0．57g／L：SDS-PAGE显示其在49000处有一条明显表达蛋白条带,Western blotting显示表达蛋白具有P30抗原特异性。结论：大量具有免疫活性的P30-CTA2／B重组蛋白在毕赤酵母中表达。为弓形虫亚单位复合疫苗的研制和大规模动物实验创造了条件。     

MLC2—糜酶融合基因在培养乳鼠心肌细胞中的表达

采用不同程度删除启动子序列的糜酶结构基因和肌球蛋白轻链-2基因（MLC2）启动子相拼接，构建了系列融合基因表达克隆。接改进的磷酸钙介导细胞转染法转染分离培养的Wistar乳鼠心肌细胞，提取细胞总RNA。经Dot-blot杂交和光密度扫描分析显示，融合基因中的MLC2启动子能有效地调控糜酶基因在心肌细胞中转录表达，糜酶结构基因ATG前含有6bP糜酶自身启动子序列的融合基因M88克隆表达水平最高，随着ATG前糜酶启动子序列的增加，融合基因在心肌细胞中的表达水平逐渐降低。     

人免疫缺陷病毒II型gag基因在毕赤酵母中表达条件的研究

目的 :提高人免疫缺陷病毒 II型 ( HIV- 2 ROD) gag基因在毕赤酵母中的表达量。方法 :研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同的甲醇诱导浓度、诱导时间、溶解氧、摇瓶转速及不同 p H值对人 HIV- 2 gag表达的影响。表达产物进一步通过盐析和 Sephadex G- 1 0 0分子筛层析柱层析分离纯化。结果 :最佳表达条件是 1 .0 %甲醇诱导 ,诱导时间 3d,大于 85 %的溶解氧 ,摇瓶转速2 5 0 r·min-1,p H6.0～ 6.5 ,目的蛋白表达量达到 2 1 mg· L-1。同时 ,经纯化后得到了纯度大于95 %的目的蛋白。结论 :获得了 HIV- 2 RODgag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中分泌表达的最佳表达条件。     

反转录病毒载体介导的人β—珠蛋白基因在小鼠体内整合和表达的？…

OBJECTIVE: To examine the in vivo properties of retroviral recombinants carrying partially deleted human beta-globin gene (delta beta) and truncated erythroid enhancer (292 bp and 341 bp of 5'HS2) at the mRNA levels following short- and long-term reconstitution in mice with infected marrow cells. METHODS: First ecotropic virus producer cell lines with higher virus titers were isolated using "ping-pong" procedures. Then the human beta-globin gene was transferred into murine hematopoietic progenitor cells and the integration and expression of transferred gene were analyzed by southern blot and RNase protection assay or RT-PCR. RESULTS: The virus titers of both recombinants increased obviously after "ping-pong" procedures. The transferred human beta-globin gene was detected in murine CFU-S12 and the expression level was about 0.5%-5% of endogenous mouse alpha-globin gene. In 3 of 14 mice surviving long-term transplanted with bone marrow cells transduced with high-titer virus, bone marrow, spleen and thymus from two mice and bone marrow and spleen from another mouse contained the intact proviral genome. Long-term expression of the transferred gene was seen in one mouse at level of 7% of endogenous murine alpha-globin gene. CONCLUSIONS: The transferred human beta-globin gene can stably integrate into murine hematopoietic stem cells mediated by retroviral vectors and express in an erythroid-specific manner.     

百日咳杆菌毒素S1亚单位与谷胱甘肽S—转移酶融合基因在大肠杆菌 …

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌中的表达。并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１，首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。     

survivin启动子的真核表达载体构建

目的构建以survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达的真核表达载体pEGFP-C1/Surv。方法用PCR扩增survivin启动子,构建其真核表达载体并检测survivin启动子的活性。结果PCR成功扩增出survivin启动子,其真核表达载体构建成功。结论survivin启动子能驱动EGFP的表达,证明其具有活性。     

PTPRO基因启动子甲基化在大肠癌中的表达及作用

目的 :研究大肠癌组织及癌旁正常组织PTPRO基因启动子甲基化状态及m RNA表达情况,并探讨其在大肠癌发生中的关系。方法 :应用甲基化特异性PCR(MSP)和RT-PCR分别检测30例大肠癌组织及癌旁正常组织中PTPRO基因启动子甲基化状态及m RNA表达状态。结果 :大肠癌组织中PTPRO基因启动子甲基化率高于癌旁正常组织,其甲基化样本中PTPRO基因m RNA表达明显受抑。结论 :PTPRO基因启动子甲基化在大肠癌发生中起着重要作用,可能与大肠癌的发生、发展及预后有关。     

MT启动子控制的GFP基因在CHO细胞中的诱导表达

用羊金属硫蛋白(MT)启动子构建含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达载体,经脂质体介导在培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行诱导性表达。结果:构建的GFP基因表达载体能在CHO细胞中进行表达,用硫酸锌诱导可提高GFP的表达量。     

高血压相关基因CAT启动子多态结构对基因转录活性作用初步研究

目的 研究高血压相关基因过氧化氢酶(Catalase,CAT)基因启动子上游区T多态结构对转录活性的影响.方法 将CAT基因启动子T多态片断插入pGFP-1报告载体GFP基因上游的多克隆位点,重组质粒转化E.coli TG1受体细胞,经蛋白电泳和荧光显微镜观察,检测GFP报告基因的表达情况.结果 显示CAT启动子上游T多态不影响GFP报告基因的表达,实验结果与人细胞中分析结果相同.结论 说明从多态遗传结构而言,CAT启动子上游T多态结构不影响转录活性.     

Nar1基因酵母表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建Nar1基因的酵母表达载体,并纯化His-Nar1融合蛋白,为进一步研究Nar1的相互作用蛋白及其功能奠定基础。方法:通过PCR扩增Nar1全长基因;通过定向克隆的方法将Nar1片段与载体pYES2/NTC连接;通过乙酸锂转化法把重组质粒转化入野生型酵母菌株INVSc1;再通过免疫沉淀的方法纯化His-Nar1融合蛋白;通过Western blot检测靶蛋白。结果:DNA测序验证穿梭表达质粒pYES2/NTC-Nar1构建成功,Western blot检测到融合蛋白His-Nar1的表达。结论:成功构建Nar1酵母过表达载体,并且可以有效表达融合蛋白His-Nar1。     

雄激素可调节的肾脏近端肾小管上皮细胞靶向杂合启动子的优化

为研究肾脏雄激素调节蛋白杂合启动子Kap147/HAGT Kpn的细胞特异性,将HAGT Kpn片段克隆到pGL3 Kap147载体质粒上,通过细胞转染和荧光素酶活性测定,证实Kap147/HAGT Kpn杂合启动子只在肾小管上皮细胞来源的OK、LLC MK2细胞中具有活性,经20 nmol/L DHT处理后其活性增加了7~8倍。依据雄激素应答原件的保守性,将不同长度的HAGT Kpn亚片段克隆到pGL3 Kap147载体质粒上,经20 nmol/L DHT处理后,KpnI StuI和MscI KpnI两个片段能够使Kap147活性增强1~2倍,由此表明Kap147/HAGT Kpn杂合启动子依然具有组织细胞特异性且受雄激素调控,KpnI StuI和MscI KpnI两个片段承担了雄激素的调控作用。     

电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响

目的 研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子，CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达。方法 利用CMV启动子，EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP,pcDNA3-EGR-GFP重组质粒，经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株，对脂质体转染条件进行优化，在最佳转染条件下，分别给予不同浓度H2O2，不同剂量γ射线处理转染细胞，用荧光显微镜，流式细胞仪（FAC）检测GFP的表达情况。结果 FACS检测显示氧自由基，电离辐射可诱导FGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达。而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达。结论 EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性。     

人源多克隆抗血清识别的HBsAg模拟表位筛选

目的 获得与乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）人源抗血清特异结合的噬菌体呈现模拟多肽,加深对乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｂ细胞表位的了解。方法 基于噬菌体小衣壳蛋白（ｇｐⅢ）构建１２氢基酸随机肽库,经混合多克隆人源ＨＢｓＡｇ阳性血清的三轮筛选,阳性噬菌体经ＥＬＩＳＡ和竞争实验证实,并测定其对应呈现多肽的插入序列,分析其氨基酸序列与ＨＢｓＡｇ的相似性,结果 两个噬菌体颗粒在ＥＬＩＳＡ实验中呈阳性,其中     

采用T7启动子系统在大肠杆菌中高效表达人白细胞介素2

将人白细胞介素2(interleukin 2.IL-2)cDNA重组于含T7启动子的表达质粒,转化专用受体菌后得到工程菌,使IL-2在大肠杆菌中的表达效率(表达产物在菌体总蛋白中所占比例)提高到32.0%,包涵体的纯度提高到82.0%,便于IL-2变性溶解与重新折叠以恢复活性.以乳糖替代异丙基硫代-β-半乳糖苷作诱导剂可获得同样的结果,使诱导剂成本降低数百倍.新的工程菌更适合用于制备基因工程人IL-2.     

自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立

【目的】构建自噬基因Beclin1启动子报告基因细胞自噬模型,为筛选出以Beclin1为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染双荧光素酶报告基因测定法,确定最佳转染浓度、时间等条件,及Beclin1基因启动子转录活性细胞自噬模型的建立和验证,观察血清饥饿、过氧化氢氧化损伤及自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素对Beclin1基因启动子转录活性PC12细胞自噬模型的影响。【结果】血清饥饿诱导12 h,Beclin1基因启动子转录活性是体积分数10%血清组的1.8倍,而血清饥饿诱导18、24 h与诱导12 h比较其转录活性无明显变化;300μmol/L过氧化氢诱导9 h,Beclin1基因启动子转录活性是0μmol/L过氧化氢组的1.3倍;雷帕霉素在浓度0.1、1 nmol/L可上调Beclin1基因启动子转录活性,并呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度的雷帕霉素可下调Beclin1基因启动子转录活性。【结论】成功建立用Beclin1基因启动子报告基因检测Beclin1基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型,血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导Beclin1基因启动子的转录活性。