恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的 扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长，并进行序列比较研究。方法 小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株，用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因，并采用TA克隆技术构建测序载体，对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长，并TA克隆到测序载体pMD18—T vector，测序结果与Karp标准株的同源性为99．4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功，为进一步构建表达载体，进行Sta56蛋白表达研究提供基础。     

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性     

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。     

恙虫病合并慢性血吸虫病发病特点及恙虫病的分型

目的了解恙虫病合并血吸虫病的发病特点以及恙虫病的分型情况。方法收集病例资料并对其进行分析,采用外斐反应和间接免疫荧光方法（IFA）检测患者血清中的恙虫病东方体（Ot）IgG抗体,用巢式PCR法扩增患者血液中的Ot 56kD蛋白基因,并进行核酸序列测定和分析。结果患者有血吸虫肝改变、肝功能受损、脾肿大、焦痂。外斐氏反应检测OXk 1：40,IFA检测Ot IgG抗体Kato型1：160、Karp型1：40,PCR检测Ot 56kD蛋白基因片断阳性,其序列分析结果与PG9、P25、CM438等一些泰国Ot株同源性最高（98%）,与Ot Karp、Gilliam、Kawasaki、TA678、Kato株同源性均在95%以下。结论证实了该患者为恙虫病合并慢性血吸虫病,其Ot血清型可能为Kato＋Karp,遗传进化关系与一些泰国Ot株关系较为密切。     

恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体,为表达该基因奠定基础。方法:以恙虫病东方体Karp株基因组为模板,通过PCR方法扩增Sta22抗原基因,并将其克隆到表达载体pEASY-E2上,通过PCR方法及核苷酸测序进行鉴定。结果:所构建的原核表达载体携带Sta22基因,基因序列与GenBank上所公布的信息完全一致。结论:成功构建了Sta22抗原基因的原核表达载体,为研制和开发新型的恙虫病疫苗及临床诊断试剂奠定理论基础及物质保障。     

恙虫病东方体0t56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从GenBank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、AthePort和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4%～100.0%,变异度为0.0～57.1;氨基酸的105～171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区;膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8%～100.0%,变异度为0.0～116.1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株(型)特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株(型)鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株(型)恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

恙虫病东方体Ot56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从Gen Bank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、Athe Port和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4％-100.0％,变异度为0.0～57．1;氨基酸的105-171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区：膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8％～100.0％,变异度为0.0～116．1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株（型）特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株（型）鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株（型）恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

佛山市南海区鼠类自然感染恙虫病东方体基因型分析

目的 调查佛山市南海区鼠类自然感染恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, Ot)的情况，了解当地Ot基因型的分布及特点，为防控恙虫病提供科学依据。方法 2017年7月利用鼠夹和鼠笼，在佛山市南海区恙虫病高发镇街采集鼠类动物样本，应用巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)扩增技术检测Ot 56kDa型特异性抗原(type-specific antigen, TSA)基因核酸片段，通过核酸序列比对确定Ot基因分型。用MEGA 10.0.5、DNAStar 7.1、MegAlign等生物信息学软件进行同源性与遗传进化分析。结果 共捕获鼠类200只，褐家鼠检出56kDa TSA基因片段6份，黄胸鼠检出1份，阳性率为3.5%(7/200)。南海序列(L65、L68、L118、L119、L122、L150和L153)在核苷酸水平与Kawasaki、Gilliam、TA763、Kato、Kuroki、Karp基因型相似性为71.8%～100.0%,氨基酸水平相似性为54.9%～100.0%。同源性和系统进化分析表明，南海...     

新疆昌吉部分地区动物感染恙虫病东方体调查

目的了解新疆昌吉部分地区野生动物自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况。方法采用多种方法捕鼠类,提取DNA,应用巢式PCR检测Ot-Sta56基因;阳性核苷酸序列片段测序,通过美国国家生物技术信息中心网站对基因序列进行BLAST比较分析。结果共捕获鼠432只、鸟类53只,仅在木垒县的鼠类、鸟类脾样本中检测到阳性片段,感染率分别为5.3%、11.1%;其他县市未检测到阳性。DNA序列分析表明,鼠类、鸟类阳性标本中扩增产物的核苷酸序列相同,碱基长度均为442bp。BLAST表明目的基因与Karp型的碱基序列同源性最高(98.5%),应属于Karp型。结论新疆昌吉地区木垒县啮齿类及鸟类动物中可能存在Ot感染。     

新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体调查

目的 调查新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体(Ot)情况,并对媒介昆虫进行调查.方法 采用多种方法捕获可能感染Ot动物取脾,当地牧民静脉取血,从野鼠体表捕获恙螨,用试剂盒提取DNA,应用巢式PCR( nPCR)检测Ot-Sta56基因;接种昆明小白鼠进行Ot病原传代分离.结果 共采取人群血液2 430份,在6份血液中检测并分离到Ot;捕获动物13种5 783个(只),从5种啮齿动物(小家鼠、灰仓鼠、大砂土鼠、草原兔尾鼠、灰旱獭)、2种鸟类(麻雀、灰腹鹡鸰)的脾中检测并分离到Ot,从绵羊血液中检测到Ot.其他动物体内未检测到Ot.从野鼠体表分离恙螨5种,从博乐纤恙螨体内检测分离到Ot.基因序列分析表明,新疆地区存在恙虫病东方体的基因型以Karp型为主,可能存在Saitama型.结论 新疆地区存在人群及动物感染Ot,其基因型以Karp为主,可能存在Saitama型.     

抗恙虫病东方体噬菌体抗体库的构建和初步筛选

目的 构建抗恙虫病东方体噬菌体抗体库并进行初步筛选,获得与恙虫病东方体膜抗原特异性结合的抗体克隆,为研制恙虫病的快速诊断试剂盒奠定基础.方法 从感染恙虫病东方体小鼠的脾细胞中提取RNA,经逆转录、PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻链基因和表达载体pComb3进行酶切、连接.转化大肠杆菌XL1-blue,构建轻链库;再对轻链重组质粒和重链Fd基因进行酶切、连接,转化大肠杆菌XL1-blue,构建组合文库,以辅助噬菌体VCS M13进行超感染.用恙虫病东方体56 kDa型特异性抗原作为筛选抗原,进行4轮富集筛选后用ELISA法进行阳性克隆的鉴定.结果 构建了库容为3.46×106的鼠源性抗恙虫病东方体的噬菌体Fab片段抗体库.经过4轮富集筛选,抗体库中的目的 抗体得以富集约160倍,并用ELISA法对其进行鉴定,得到了7个阳性克隆.结论 构建的抗恙虫病东方体噬菌体抗体库,库容为3.46×106,滴度为2.5×1012 cfu/ml,基本上达到了建库要求,能够满足多样性的需求,并成功的筛选出抗恙虫病东方体56 kDa蛋白的抗体,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行了初步鉴定,认为具有一定的特异性.     

2012～2013年广州市人感染恙虫病东方体基因型分析

目的了解广州市人感染恙虫病东方体基因型的分布及特点。方法收集2012~2013年广州市恙虫病临床诊断病人全血,测定型特异性抗原基因部分序列,并进行基因序列同源性及系统进化分析。结果 133份标本中检测到40份阳性,其中Karp型21株,Kato型10株,Gilliam型5株,TA763型3株,未知型别1株。同源性分析显示其传播来源可能与台湾、日本、泰国等有关。结论广州市恙虫病东方体流行型别具多样性,来源复杂,开展更多分子流行病学研究将有助于其防控。     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

海南省发热患者血标本中恙虫病东方体groEL基因检测

目的了解海南省发热病人中感染恙虫病东方体的状况,并确定其基因分型。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省各家医院2009~2010年送检的117份不明原因发热病人血标本的groEL基因的特异性片段,对所检测到的部分目的片段进行基因测序,从基因水平进一步证实阳性结果,并对序列同源性及进化分析。结果从117份发热病人血标本中发现有恙虫病东方体阳性15份,检出率为12.8%。取10份PCR阳性产物进行测序,核酸序列基本一致,彼此间仅存在3个核苷酸的差异,构建进化树进行聚类分析,结果示海南省恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体在同一分支上,同源性高。结论海南省发热病人中存在恙虫病东方体感染的状况,应加强相关监测和防控措施,为给海南省制定恙虫病防治策略提供科学依据。     

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆?表达及表达产物的纯化

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达.并纯化融合表达的vIL-6.方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和peD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基冈片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8 ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6伞长基因的重组原核表达质粒pvIL-6.重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.用glutathione Sepharese 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况.结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源:IPTG诱导后的菌体.经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生.Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带.结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8 ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化vIL-6融合蛋白.     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。     

Genotype identification of Orientia tsutsugamushi isolated from Nan Peng Lie Islands in China

目的：为确定我国南澎列岛是否为恙虫病疫源地,对来自该地的８个恙虫病东方体分离株进行基因鉴定。方法;应用套式聚合酶链反应（NPCR）和限制片段长度多态性分析（RFLP）,NPCR的引物来自恙虫病东方体５６kDa蛋白基因,NPCR阳性产物由HincII和PstI消化并产生特异性酶切图谱予以分析。结果;南澎列岛的8个恙虫病东方体分离株属三个型,即Karp,Kato和一新型恙虫病东方体。结论：南澎列岛是恙虫病疫源地。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

基因重组型人SORL1蛋白质片段的原核表达和纯化

目的制备基因重组型人SORL1蛋白质片段,为探讨阿尔茨海默病的发病机制提供实验基础。方法采用PCR方法扩增人sorl1 cDNA编码区5 923～6 260 bp片段,克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达重组质粒,用液相色谱法纯化基因重组蛋白。结果 PCR扩增产物为358 bp,其ATG和TGA之间的结构与人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp区完全一致。基因重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中高效表达,其表达产物存在于包涵体组分中。纯化的基因重组蛋白在SDS-PAGE中表现为单一条带,表观分子量约为13 000。结论人sorl1 cDNA的5 923～6 260 bp片段在原核细胞中大量表达,纯化后的基因重组蛋白可尝试用于抗体的制备。