紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞株的生物学特性及其保存

目的 研究紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞株的生物学特性,探索耐药细胞的长期保存条件,以建立稳定的体外实验模型。方法 选用卵巢癌化疗敏感细胞株SKOV3,分别采用大剂量冲击和小剂量浓度递增诱导建立耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测耐药细胞对化疗药物紫杉醇的IC50;比较耐药细胞和敏感细胞的细胞平板克隆形成、生长曲线倍增时间的差异;荧光定量PCR检测敏感细胞和耐药细胞中耐药相关基因的表达;比较无药冻存和加药冻存的方式对耐药细胞的保存效果。结果 耐药细胞SKOV3/TAX300,耐药指数为4.60,耐药细胞SKOV3/TAX30,耐药指数为51.31;与敏感细胞相比,耐药细胞体积增大,形态不规则,倍增时间延长。多药耐药基因1（MDR1）在两种耐药细胞中高表达,肺耐药相关蛋白（LRP）、蛋白激酶Cα（PRKCA）基因仅在SKOV3/TAX300中的表达增高,BCL-2样1基因（BCL2L1）在SKOV3/TAX30中低表达。耐药细胞冻存在含有药物的条件下,有利于耐药性的保持。结论 大剂量冲击和小剂量浓度递增两种方法诱导的耐药细胞为研究紫杉醇耐药机制建立了良好的体外模型,两种耐药细胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30具有不同的生物学特性。     

人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其生物学特性研究

目的建立耐紫杉醇的人肺腺癌细胞株模型SPC-A1/Taxol,并初步研究其生物学特性。方法应用浓度递增和短时作用法,从人肺腺癌细胞株SPC-A1中诱导分离出对紫杉醇耐药的细胞亚株(SPC-A1/Taxol)。采用MTT法检测耐药细胞的耐药指数及对抗癌药物的敏感性;光镜和透射电镜观察细胞形态;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布;以免疫细胞化学染色检测多药耐药基因(mdr1)的表达产物P-糖蛋白(P-gp)。结果经MTT法检测,SPC-A1/Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代SPC-A1细胞的759.46倍,对Taxotere、NVB、ADM呈高度耐药状态,对VP-16和HCPT有轻度的耐药,而对DDP、GEM以及中药榄香烯乳无交叉耐药现象。耐药细胞的群体倍增时间是亲代细胞的1.32倍;细胞形态未见明显改变;G0 G1细胞比例减少,S期细胞增多。SPC-A1细胞无P-gp表达,SPC-A1/Taxol则高表达P-gp。结论SPC-A1/Taxol肺腺癌细胞株是一个明确的多药耐药模型,具有耐药细胞的基本生物学特性,推测其多药耐药性与P-gp的高表达相关。     

紫杉醇耐药卵巢癌细胞系的建立及耐药机制研究

目的建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株,探讨其耐药机制。方法采用梯度浓度递增法诱导建立对紫杉醇（Paclitaxel,TAX）耐药的人卵巢癌细胞耐药株SKOV3／TAX,MTF法检测SKOV3／TAX对SKOV3的耐药指数（resistanceindex,RI）,WesternBlot法检测耐药细胞中凋亡及耐药相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶（polyADP．ribosepolymerase,PARP）的表达情况,探讨其耐药机制。结果成功建立人卵巢癌耐紫杉醇细胞株SKOV3/TAX,耐药指数高达88．46;与SKOV3相比,紫杉醇耐药细胞株形态较不规则,细胞扁平,且贴壁较牢;WesternBlot及免疫荧光实验均证实SKOVMTAX中PARP水平明显下调,且加用TAX后PARP的剪切带较亲本细胞明显减少甚至缺失。结论紫杉醇耐药卵巢癌细胞中PARP蛋白表达明显下调,该下调很可能参与了卵巢癌对紫杉醇的耐药调控。     

卵巢癌紫杉醇耐药机制的研究进展

紫杉醇是美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士于1967年发现的。他们从太平洋红豆杉中分离出了这种化合物并发现它具有广泛的抗恶性肿瘤作用。紫杉醇分子是一个极其复杂的四环二萜类化合物,它是继长春新碱之后又一类具有新作用机制、抗微管解聚的细胞毒类药物。1992年经FDA批准紫杉醇作为治疗卵巢癌的新药应用于临床,随后又批准用于治疗乳腺癌。     

人胃癌耐药细胞株SGC-7901/HCPT的耐药机制初探

目的:探讨人胃癌耐羟基喜树碱细胞株即SGC-7901/HCPT的耐药机制.方法:通过光镜和电镜观测SGC-7901/HCPT与人胃癌细胞株即SGC-7901形态和超微结构差异和免疫细胞化学的方法检测SGC-7901/HCPT与SGC-7901之间的TOPO-Ⅰ、TOPO-Ⅱ、P-gp、GST-π、BCL-2表达异同来探讨SGC-7901/HCPT的可能耐药机制.结果:(1)光镜下SGC-7901/HCPT细胞大小不一致,形态不规则,胞浆较丰富,核小而不规则,可见巨核现象;而SGC-7901细胞呈圆梭形,大小一致,核圆形;电镜下SGC-7901/HCPT表面指状突起明显,胞浆内有较多的核糖体及粗面内质网,线粒体较多.(2)SGC-7901/HCPT的TOPO-Ⅰ表达较SGC-7901明显增加,差异具有显著性;而TOPO-Ⅱ、P-gp、GST-π、BCL-2的表达差异无显著性.结论:SGC-7901/HCPT趋向细胞成熟分化,这可能是其产生耐药的形态学表现.TOPO-Ⅰ的表达下降则可能是SGC-7901/HCPT耐HCPT形成的分子基础.     

人胃癌耐药细胞株SGC-7901／HCPT的耐药机制初探

目的:探讨人胃癌耐羟基喜树碱细胞株即SGC-7901/HCPT的耐药机制。方法:通过光镜和电镜观测SGC-7901/HCPT与人胃癌细胞株即SGC-7901形态和超微结构差异和免疫细胞化学的方法检测SGC-7901/HCPT与SGC-7901之间的TOPO-Ⅰ、TOPO-Ⅱ、P-gp、GST-π、BCL-2表达异同来探讨SGC-7901/HCPT的可能耐药机制。结果:(1)光镜下SGC-7901/HCPT细胞大小不一致,形态不规则,胞浆较丰富,核小而不规则,可见巨核现象;而SGC-7901细胞呈圆梭形,大小一致,核圆形;电镜下SGC-7901/HCPT表面指状突起明显,胞浆内有较多的核糖体及粗面内质网,线粒体较多。(2)SGC-7901/HCPT的TOPO-Ⅰ表达较SGC-7901明显增加,差异具有显著性;而TOPO-Ⅱ、P-gp、GST-π、BCL-2的表达差异无显著性。结论:SGC-7901/HCPT趋向细胞成熟分化,这可能是其产生耐药的形态学表现。TOPO-Ⅰ的表达下降则可能是SGC-7901/HCPT耐HCPT形成的分子基础。     

卵巢癌多细胞球体对紫杉醇耐药及其机制的探讨

背景和目的:多细胞球体(multicellularspheroids,MCS)对传统细胞毒化疗药物的敏感性明显低于单层细胞。本实验旨在探讨卵巢癌MCS耐药的分子机制。方法:以单层细胞为对照,以三维培养方法获得的人卵巢癌A2780MSC和CAOV3MCS为模型,采用台盼蓝拒染法比较紫杉醇对单层细胞和MCS生长的抑制作用,流式细胞仪比较单层细胞和MCS细胞周期的分布和细胞凋亡率;采用流式细胞仪、蛋白质免疫印迹法、激光共聚焦显微镜检测单层细胞及MCS的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达及亚细胞分布;采用RT-PCR法检测mdr1mRNA表达水平。结果:(1)不同浓度的紫杉醇(0.2、2.0、10.0、20.0μmol/L)作用后,MCS细胞生长抑制率明显低于单层细胞(PA2780=0.003,PCAOV3=0.015);经20.0μmol/L的紫杉醇作用后,单层细胞的细胞凋亡率明显高于MCS,差异有统计学意义(PA2780=0.034,PCAOV3=0.032)。(2)流式细胞仪、蛋白质免疫印迹法、激光共聚焦显微镜检测提示P-gp在单层细胞中不表达,在MCS中表达明显升高(P均<0.05);RT-PCR证实MCS中有mdr1mRNA表达,而单层细胞中未检出其表达。(3)流式细胞仪检测提示将单层细胞培养成MCS时,G0/G1期细胞比率增加,S期和G2/M期细胞比率降低(P均<0.05)。结论:卵巢癌MCS对紫杉醇化疗耐药性增加,其高表达P-gp,并且与G0/G1期细     

自噬抑制剂促进紫杉醇耐药卵巢癌细胞对化疗敏感性的研究

目的 探讨自噬激活在紫杉醇(paclitaxel, PTX)耐药卵巢癌(ovarian cancer)细胞中的作用及自噬抑制对耐药细胞化疗的影响。方法 以卵巢癌细胞系SKOV3和紫杉醇耐药卵巢癌细胞(SKOV3/PTX)为研究对象;利用MTT实验检测细胞活力变化;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;免疫印迹(Western blot, WB)法检测蛋白表达变化;利用脂质体瞬时转染法使细胞表达LC3-GFP-RFP荧光蛋白;利用激光共聚焦显微镜检测细胞荧光蛋白定位及表达。结果 相比SKOV3细胞,相同剂量的PTX对SKOV3/PTX细胞的活力抑制能力明显降低,紫杉醇对SKOV3细胞和SKOV3/PTX细胞的半数抑制浓度((inhibitory concentration 50%,IC50)分别为(41.91±2.92)μM和(114.6±17.6)μM。此外,在凋亡水平上,PTX对SKOV3/PTX细胞的诱导凋亡作用显著降低。通过LC3-GFP-RFP过表达和LC3、p62蛋白检测,证明SKOV3/PTX细胞的自噬激活程度增高。采用自噬抑制剂氯喹(chloroquine, CQ)...     

卵巢癌中紫杉醇耐药机制与克服耐药策略的研究进展

化疗耐药是卵巢癌复发的主要原因,严重影响患者的预后。紫杉醇是卵巢癌化疗的一线用药之一,因此,有关紫杉醇耐药的机制和克服耐药的策略得到了广泛而深入的研究。本文简要介绍了近年来有关紫杉醇耐药和克服耐药策略的研究进展。     

人突变K-ras基因修饰lewis肺癌细胞株的建立及其生物学特性

目的:探讨以K-ras基因为靶点,建立人K-ras(12位密码子点突变)基因修饰的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12及其生物学特性.方法:应用脂质体法将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,应用流式细胞仪检测p21/V12蛋白的表达,同时检测3LL细胞株转基因前后生长、克隆形成率和体内成瘤的变化.结果:成功的将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,p21/V12蛋白在3LL-pcDNA3-K-ras/V12中稳定表达,转基因细胞株的生长曲线和克隆形成率与原代细胞株3LL无显著差异;但转基因细胞株在C57BL/6小鼠体内的成瘤性显著高于原代细胞株3LL.结论:成功的建立了导入K-ras(12位密码子点突变)的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12.     

人喉癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的:建立人喉癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)耐药细胞系,为喉癌的耐药机制研究提供模型。方法:以高剂量浓度递增间歇给药的方法诱导筛选人喉癌Hep-2的多药耐药细胞株Hep-2/5-FU,比较两组细胞的形态和倍增时间;MTT法确定细胞的IC50及其耐药指数;流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布以及细胞内的罗丹明聚集;实时定量PCR法检测MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测相应MDR1-P蛋白的表达。结果:建成性能稳定的Hep-2/5-FU耐药细胞株,并与顺铂及长春新碱有不同程度的交叉耐药性,且Hep-2/5-FU细胞倍增时间较Hep-2细胞延长[(31.25±4.37)h vs(25.62±3.53)h,P<0.05]。Hep-2/5-FU细胞G0/G1期比例升高[(45.6±3.4)%vs(30.5±1.2)%,P<0.05],而S期比例明显降低[(32.1±4.2)%vs(52.4±3.6)%,P<0.05];Hep-2细胞内的罗丹明较Hep-2/5-FU细胞明显升高[(89.83±0.52)%vs(14.38±0.48)%,P<0.01];Hep-2/5-FU细胞MDR1 mRNA[(13.69±1.12)vs(17.82±0.61),P<0.05]及其编码的MDR1-P蛋白水平高于Hep-2细胞。结论:Hep-2/5-FU细胞株具有明确及稳定的多药耐药性,为喉癌的耐药机制提供了研究的模型。     

K562／ADM耐药细胞株的建立及其生物学特性的初步观察

我们建立的K562/ADM耐药细胞株,在ADM浓度为2.4μg/m1(4.46μM)中已稳定培养3.5个月,传了30—35代,K562/ADM亦具有多药耐受件(Multidrug Resistance,MDR)的特点,对ADM、VCR、AT—1258和DDP的耐受性分别为K562的114.7、94.0、13.3和7.4倍,但对5—FU不产生交叉耐药。K562和K562/ADM的倍增时间分别为19.2h和52.8h,集落生成率分别为37.5％和11.1％,K562染色体数为34—68,中位数为56;K562/MDM染色体数为32—90,中位数为50,K562/ADM可做为耐药机理和克服耐药措施研究的极好模型。     

米非司酮对人耐药卵巢癌细胞增殖、凋亡及其对紫杉醇敏感性的影响

背景与目的:米非司酮是有效的孕酮受体拮抗剂。研究发现,米非司酮对体内外卵巢癌细胞均具有生长抑制作用,但机制尚不清楚。本研究旨在探讨米非司酮对人耐药卵巢癌细胞A2780/T增殖、凋亡及其对紫杉醇敏感性的影响,为临床应用米非司酮治疗耐药性卵巢癌提供实验依据。方法:体外培养人卵巢癌耐药细胞A2780/T,采用CCK-8法检测单用米非司酮及合用紫杉醇时对A2780/T细胞增殖的影响,分析米非司酮与紫杉醇在抑制耐药卵巢癌细胞增殖中的相互作用。采用流式细胞术分析米非司酮及米非司酮联合紫杉醇对A2780/T细胞凋亡的影响。结果:实验所选各种浓度(0.625～20μg/mL)米非司酮对A2780/T和A2780细胞均有一定程度的生长抑制作用,并呈浓度依赖性。当紫杉醇浓度为1.25或2.5μg/mL,合用米非司酮浓度为20、10、5、2.5、1.25或0.625μg/mL时,能显著抑制A2780/T细胞的增殖,并显示两种药物的协同作用(q>1.15)。当紫杉醇浓度为0.625或5μg/mL时,仅表现为两种药物的相加作用(0.85相似文献   

人类卵巢癌顺铂耐药细胞株OV1228／cDDP的建立及其生物学特性

 目的　建立人类卵巢癌细胞顺铂耐药细胞株OV1228／cDDP,并对其生物学特性进行检测。方法　采用顺铂浓度梯度递增法,建立人类卵巢癌顺铂耐药细胞株。通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、mdr-1和PKC-α基因及蛋白表达水平的测定,来评价OV1228／cDDP的生物学特性。结果　成功建立了OV1228／cDDP耐药细胞株,耐药指数（RI）为5.97,对多柔比星和5-氟尿嘧啶具有一定的交叉耐药性。与OV1228相比,OV1228／cDDP细胞异型性增加、细胞倍增时间延长;mdr-1和PKC-α在基因和蛋白表达水平均明显增高。结论　OV1228／cDDP细胞对顺铂耐药性稳定,并呈现一定的多药耐药特性,为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。     

紫杉醇诱导的卵巢癌耐药基因表达谱与信号通路分析

目的:探讨卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药分子机制.方法:取对数生长期细胞按Trizol一步法抽提细胞总RNA,应用人类全基因组基因芯片检测卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TS与敏感细胞株SKOV3细胞基因表达谱的变化,GO TermMapper软件鉴定差异基因功能,进一步利用IPA软件分析基因通路网络,筛查获得性紫杉醇卵巢癌耐药...     

人紫杉醇耐药细胞株LoVo/TAX的建立及其耐药机制研究

目的:以体外建立的人结肠癌紫杉醇（paclitaxel,TAX）耐药细胞株LoVo/TAX为模型,探讨结肠癌紫杉醇获得性耐药潜在的分子机制。方法:对LoVo亲本细胞及LoVo/TAX耐药细胞进行对比分析,采用光镜及透射电镜观察细胞形态,MTT法检测细胞药物敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR方法和Western blot方法分别检测多药耐药相关基因、微管蛋白相关基因以及凋亡和细胞周期调控相关基因的转录和翻译水平。结果:与亲本细胞相比,LoVo/TAX对紫杉醇高度耐药,细胞形态也有明显变化,其G2/M期阻滞降低(P<0.05),凋亡率显著下降(P<0.01),MRP、MAP-Tau和CDK1基因表达水平提高(P<0.05)。结论:多药耐药相关蛋白MRP1、微管相关蛋白MAP-Tau以及细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）过表达可能是引起结肠癌细胞对紫杉醇耐药的主要原因。     

小鼠Lewis肺癌细胞株L3-8的建立及生物学特征

为了得到高转移率的小鼠肺癌体外传代细胞株，将Ｌｅｗｉｓ肺癌实体瘤组织在体外进行１４个月的传代培养，获得了Ｌ３－８细胞株。对该细胞生物学特征的研究结果表明，第３９代和第６５代细胞的倍增时间分别为２３．５ｈ和２６．２ｈ；第８０代细胞的平皿和软琼脂集落形成率分别为３０．７％和２１．２％；在Ｃ５７ＢＬ小鼠体内的成瘤率为１００．０％，肺转移率为８３．３％，平均转移灶２．９个。此细胞株较原体内传代株具有更高的转移率，为肿瘤细胞生物学、免疫学和药理学等的研究提供了一种良好的实验模型     

重组改构人TNF逆转卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP的耐药性及其机制

目的: 探讨重组改构人肿瘤坏死因子（recombinant mutant human tumor necrosis factor, rmhTNF）体外逆转人卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/DDP的耐顺铂（cisplatin,又称DDP）效应及其可能存在的作用机制。方法: 体外培养人卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/DDP，以MTT法检测rmhTNF对此耐药株的细胞毒作用，确定其对此细胞株的无毒剂量;同法测定无毒剂量rmhTNF干预后SKOV3/DDP对顺铂耐药性的变化，通过流式细胞术检测rmhTNF干预不同时间段SKOV3/DDP细胞株中GSTπ蛋白的表达，RTPCR方法分析rmhTNF处理SKOV3/DDP细胞前后MDR1基因的表达水平。结果: （1）50～12234 U/ml rmhTNF对SKOV3/DDP细胞增殖无明显抑制作用（细胞存活率均﹥90%），因此选用100 U/ml 作为逆转剂量（无毒剂量）;（2）单用DDP 24、48、72 h 的IC50为(23.29±0.43)、(8.97±0.69)、(6.43±0.79)μg/ml，联合100 U/ml rmhTNF和DDP用药使SKOV3/DDP的IC50分别降至（19.50±0.50）、（4.34±0.43）、（2.44±0.02）μg/ml，逆转倍数分别为1.19、206、2.64倍;（3）100 U/ml rmhTNF干预0、24、48、72 h后SKOV3/DDP细胞内GSTπ蛋白的表达随作用时间延长降低，MDR1基因的表达随作用时间延长降低。结论: rmhTNF对SKOV3/DDP有逆转耐药作用，其机制可能与下调GSTπ蛋白及MDR1基因表达有关。     

人脊索瘤细胞系CM-3l9的建立及其生物学特性的观察

目的 建立人脊索瘤细胞系，为脊索瘤研究提供实验型。方法 取经病理证实的新鲜脊索瘤手术标本，进行体外原代组织块培养。对存活细胞进行形态学观察、组织化学染色、细胞周期检查、染色体分析、电镜观察、异种移植和体外侵袭实验等。结果 建成细胞系CM-319，经近两年的体外培养，已连续传代百余次，其形态学表现、组织化学染色、电镜观察和异种移值等均符合脊索瘤细胞特征。细胞倍增时间为33h。细胞周期测定显示：G1期为55．6％，G2期为21．9％，S期为22．5％，G2／G1为1．90。染色体具有亚三倍体核型。异种移植成瘤率100％，具有侵袭性。结论 CM-319是一株人脊索瘤细胞系，可用于对脊索瘤的研究。     

Celecoxib抑制人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV-3/DDP增殖及其机制的研究

[目的]探讨选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂celecoxib对人卵巢癌耐药细胞株SKOV-3/DDP的增殖抑制作用并初步探讨其机制。[方法]用不同浓度celecoxib作用SKOV-3/DDP细胞不同时间后,MTT法检测细胞增殖抑制情况,RT-PCR法检测细胞中survivin及GST-πmRNA的表达情况,FCM法检测细胞survivin及GST-π蛋白表达情况。[结果]celecoxib可以抑制SKOV-3/DDP细胞的增殖,呈药物浓度及时间依赖性。RT-PCR法检测发现与未处理组相比,celecoxib可下调SKOV-3/DDP细胞中survivin及GST-πmRNA的表达(P<0.01),FCM法检测显示celecoxib可下调细胞中survivin及GST-π蛋白表达(P<0.01)。[结论]celecoxib能抑制SKOV-3/DDP细胞增殖,并呈浓度及时间依赖性,其机制可能与下调survivin及GST-π表达相关。